当前位置：文档之家 › 第11章 基因工程新技术

第11章 基因工程新技术

  • 格式：ppt
  • 大小：3.19 MB
  • 文档页数：67

下载文档原格式

  / 67

合集下载

第11章基因工程新技术PPT资料68页

第11章基因工程新技术PPT资料68页

2019年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重 组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极 低：约40bp。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着 该技术的应用，出现了一个新的术语：
Recombineering (recombination-mediated genetic engineering) is a genetic and molecular biology technique based on homologous recombination systems in E. coli and other bacteria mediated by phage proteins, either RecE/T from Rac prophage or Red alpha/beta/gamma from bacteriophage lambda
如果向细胞中导入 ssDNA (DNA oligo),则不需要Exo蛋白就能 够与同源区退火，实际上， Bet单独作用可以 使70-base ssDNA oligo (SSO)与染色体的同源区退火互补而发生重组， 其频率约 2 × 105 / 108 ,比dsDNA 略高。
如果存在 Gam蛋白，则重组效率可提高 (5-fold）.40–60 bp 单链的重组效率下降 5倍。另外，和滞后链重组的效率高于 前导链。
第11章 基因工程新技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用 2. 位点特异性重组系统及其应用 3. 基因打靶 4. 基因抑制技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用
早在1990s, 研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源 重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以 方便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。

课件11：6.2 基因工程及其应用

课件11：6.2 基因工程及其应用

标记基因， 便于进行 检测。
常用的运载体： 质粒、噬菌体和 动植物病毒等
质粒存在于许多细 菌和酵母菌等生物中, 是细胞染色体外能够 自主复制的很小的环 状DNA分子.
三、基因工程基本步骤
1、获取目的基因
提取目的基因的方法
⑴直接分离基因——鸟枪法 将供体生物的DNA用限制
酶切割为许多片段，再用运载体 将这些片段都运载到受体生物的 不同细胞中去。只要有一个细胞 获得了需要的目的基因并得以表 达，基因工程就算成功了。
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工 业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导 入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但 能解决产量问题，还能大大降低生产成本。
3、环境保护 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多 种污染环境的物质。
通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用 基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中 的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重 金属，分解DDT等毒害物质。
限制性内切酶（EcoRⅠ）作用过程 黏性末端
黏性末端
２、基因的针线──DNA连接酶
连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端 连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
用同种限制酶切割
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
基因的针线：DNA连接酶
G AA TT C C TT AA G
DNA连接酶连接 的是DNA骨架上 的缺口，不是碱 基间的氢键
3、基因的运输工具——运载体
运载体必须同时满足三个要 求： ①具有一到多个限制酶的酶 切位点,以便与外源基因连接; ②能进入受体细胞并在受体 细胞内稳定存在并能复制、 表达； ③具有标记基因,便于目的基 因的筛选.

(NEW)沈萍《微生物学》(第8版)配套题库【考研真题精选+章节题库】

(NEW)沈萍《微生物学》(第8版)配套题库【考研真题精选+章节题库】

目　录第一部分　考研真题精选一、选择题二、填空题三、名词解释四、简答题五、论述题第二部分　章节题库第1章　绪　论第2章　微生物的纯培养和显微技术第3章　微生物细胞的结构与功能第4章　微生物的营养第5章　微生物的代谢第6章　微生物的生长繁殖及其控制第7章　病毒第8章　微生物遗传第9章　微生物基因表达的调控第10章　微生物与基因工程第11章　微生物的生态第12章　微生物的进化、系统发育和分类鉴定第13章　微生物物种的多样性第14章　感染与免疫第15章　微生物生物技术第一部分　考研真题精选一、选择题1柯赫提出的证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则是（ ）。

[武汉科技大学2019研]A．巴斯德原则B．柯赫定律C．菌种原则D．免疫原理【答案】B【解析】柯赫在对病原细菌的研究中取得了突出的成就：①证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌；②发现了肺结核病的病原菌；③提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则——柯赫原则；④配制培养基及创建了分离、纯化微生物的技术等。

2菌种的分离、培养、接种、染色等研究微生物的技术发明者是（ ）。

[中国计量大学2019研]A．巴斯德B．柯赫C．列文虎克D．别依林克【答案】B3用牛肉膏作培养基能为微生物提供（ ）。

[中国计量大学2019研]A．C源B．N源C．生长因素D．A，B，C都提供【答案】D【解析】牛肉膏富含水溶性糖类、有机氮化合物、维生素、盐等，可以为微生物提供C源、N源和生长因子。

4某种生物通过产生特殊代谢产物或改变环境条件来抑制或杀死另一种微生物的现象称为（ ）。

[沈阳农业大学2019研]A．拮抗B．共生C．寄生D．捕食【答案】AB项，共生指相互作用的两个种群相互有利，二者之间是一种专【解析】性的和紧密的结合，是协同作用的进一步延伸。

C项，寄生指一个种群对另一种群的直接侵入，寄生者从寄主生活细胞或生活组织获得营养，而对寄主产生不利影响。

D项，捕食指一个种群被另一个种群完全吞食，捕食者种群从被食者种群得到营养，而对被食者种群产生不利影响。

第11章抗病育种

第11章抗病育种

轮回选择法（可以积累多个抗性基因） ①选用若干个具有水平抗性的亲本系，随机交配，
混合授粉，繁殖成综合品种群体。 ②从中选出若干抗性强的优株自交（人工辅助）。 ③自交后代按病害类别分成几份，分别种植，接种
鉴定，从中再选择具有多抗性的10～20个优系， 再互交，混合授粉，组成第一轮改良的多抗群体。 ④在第一轮的基础上，按上述程序进行第2、3...轮 的选择。
2、病原菌的生理小种
同一种病原菌（种或变种）可以分化出不 同的类型，它们对不同品种有不同的毒性，某个 特定病原菌类型称为生理小种，也叫毒性小种 。
生理小种在形态上难以区分，只能用一套抗 病能力不同的鉴别寄主来区分。 要求：鉴别力 强；抗性反应稳定；具有不同的抗病基因；有代 表性的纯系品种。
3、生理小种的消长
➢ 毒性基因只能克服相应的抗性基因而产生毒 性效应。
➢ 在寄主—寄生物系统中，任何一方的上述基 因，都只有在对方相对应基因的存在下，才 能被鉴别出来。
病原菌 小种
0 1 2 3
基因型 A1A1A2A2
甲 r1r1r2r2
感病
a1a1A2A2 感病
A1A1a2a2 感病
a1a1a2a2 感病
寄主品种及其基因型
种工作较好国家或地区收集。 3、从育种的后代材料鉴定筛选。 4、从近缘种属植物中挖掘。
（二） 抗病品种选育方法 1、引种 2、选择育种 3、杂交育种
除采用常规的系普法、混合法选育单基因 或少数主基因抗性外，在选育由多基因控制的、 或者抗多种病虫害的品种时： ➢异花授粉作物可采用轮回选择法。 ➢自花授粉作物可采用双列选择交配法 。
品种的抗性表现，与品种本身、病原（虫）数量和 侵染力以及环境条件等因素相互作用的结果。

第十一章 转座因子的遗传分析

第十一章 转座因子的遗传分析

Ac：激活因子
17
转座元件的结构:真核生物的转座元件 Ac-Ds系统： Ac： 4565 bp 末端反向重复序列（11 bp） 自主元件 转座酶基因 Ds： Ac的缺失序列，结构多样 末端反向重复序列（6~13） 非自主元件
18
四、转座的分子机制
转座子
复制转座机理
第一步：转座酶识别转座子
单链
质粒DNA（双链）
单链之间由于互补形成茎环结构
2、转座基因的转移不是IS序列从某一位置切离，而 后插入到染色体新的位置，而是通过复制及重组过 程，在新的位置插入，同时新位置的转座子两侧出 现正向重复序列
IS整合到一个新的靶部位时，在插入部 位两侧形成正向重复序列：
AC GATGTC G CAGAGTATG C TG CTACAG C GTC TCATAC G
含有Is的质粒经变性后形成柄环结构
当一个IS插入“靶”DNA后，其两端会出现一 小段正向重复序列（约5-11个核苷酸对）。
插入位点形成正向重复序列的机制
二、转座子：
使宿主菌获得一定特性
大(2000-25000bp)，转座有关的基因,抗药性及其他基 因，两端具相同或同源序列。如IR序列。
Tn3的结构模式图
2 . 外显子改组: 两个转座子被同一转座酶识别整合于染色体邻 近位置,其间的外显子易被转座酶作用而转座, 造成外显子重组,产生新基因。
渗漏突变（leaky mutation):允许残留水平的基因表 达的突变。
转座子
Exon 1A
Exon 3A 转座酶作用下 切离 Exon Exon 1B 2A 转座
第十一章 转座因子的遗传分析
学习要点： 1 名词概念:转座因子,转座基因,移动基因.渗漏 突变， 2 3 4 5 移动基因的发现 转座基因的特点及转座的三种机制 转座的遗传效应 五、转座因子的应用：

第11章转座子的遗传分析

第11章转座子的遗传分析

总长度 768bp
5bp
41bp
1327bp
11~13bp 18bp
1428bp
4bp
16bp
1195bp
9bp
22bp
1329bp
9bp
9bp
1531bp
插入位点 随机 热点 AAAN20TTT 热点 NGCTNAGCN 热点
含有IS序列的质粒经变性复性后形成茎环结构。
2. 转座子（transposon, Tn）
pol LTR, 340bp
2. 果蝇的P因子
• 1977年，Kidwell报道黑腹果蝇的特定品系间 杂交后会导致杂种劣育（hybrid dysgenesis）
P雌×M雄
M雌×P雄
F1正常
F1不育
• 研究表明，P品系果蝇细胞中含有导致杂种劣 育的转座子，称为P因子。
3.0 kb
内含子3的剪接是转座
A1a1 Dtdt
A1- Dt- 9/16 a1a1 Dt- 3/16
A1- dtdt 3/16 a1a1 dtdt 1/16
转座子的发现： 遗传学史上的又一里程碑
"for her discovery of mobile genetic elements"
1983
玉米籽粒的颜色
• A：花色素基因，突变后籽粒没有颜色； • C：颜色基因，决定红色和紫色的发生； • R：控制红色性状，但要求A、C基因的表达； • Pr：控制紫色性状，要求A、C、R均显性； • I：抑制基因，可抑制C基因的表达，即Ds基因，
• DNA转座子 • 反转录转座子（retrotransposon）
按照物种进行划分：
• 原核生物转座子： – 插入序列（insertion sequence） – 转座因子（transposon） – 转座噬菌体（mutator phage）

环境微生物学ch11

环境微生物学ch11

2）质粒分子育种
是在恒化器长期混合培养过程中，增加选 择压力，通过各种微生物间质粒的自然传 递和相互作用，实现降解性质粒的自然转 移，从而大大缩短了自然进化的进程，实 现了加速培育新菌株的目的。
除草剂2, 5除草剂2, 4, 5-T（2,4,5三氯苯氧乙酸）化学结构稳定，很难 2,4,5三氯苯氧乙酸）化学结构稳定，很难 从自然界分理出以2,4,5从自然界分理出以2,4,5-T为唯一碳源的菌株； Chakrabarty等人从堆放有毒废物垃圾的地方采集样品，分 Chakrabarty等人从堆放有毒废物垃圾的地方采集样品，分 离菌种并将其接种至恒化培养器中，与带有CAM、SAL、 离菌种并将其接种至恒化培养器中，与带有CAM、SAL、 TOL、pAC21、pAC25和pAC31等降解性质粒的一些假单胞 TOL、pAC21、pAC25和pAC31等降解性质粒的一些假单胞 菌混合培养，试验初期，向培养基中加入低浓度的2,4,5菌混合培养，试验初期，向培养基中加入低浓度的2,4,5-T 和较高浓度的甲基苯甲酸盐、水杨酸盐、氯代苯甲酸盐， 连续培养一段时间后，逐渐增加2,4,5连续培养一段时间后，逐渐增加2,4,5-T的浓度，降低其他 物质的浓度，经过近10个月的培养，从中分离获得了一株 物质的浓度，经过近10个月的培养，从中分离获得了一株 以2,4,5-T为唯一碳源的细菌，经鉴定为洋葱假单胞菌，命 2,4,5名为AC 1100。 名为AC 1100。 AC 1100具有的降解2,4,5-T的功能是由质粒控制的。 1100具有的降解2,4,5单独以2,4,5- 为唯一碳源进行长期驯化，未能获得以2,4,5单独以2,4,5-T为唯一碳源进行长期驯化，未能获得以2,4,5-T 为唯一碳源的降解菌。
三、基因工程在环境保护中的应用

生化习题集第十一章 分子生物学常用技术及其应用

生化习题集第十一章 分子生物学常用技术及其应用

第十一章分子生物学常用技术及其应用一、名词解释1．DNA重组 2．基因工程3．限制性核酸内切酶 4．基因组DNA文库5．cDNA文库 6．聚合酶链反应（PCR）7．载体 8．转化9．感染 10．核酸分子杂交11．Southern印迹杂交 12．Northern印迹杂交13．斑点印迹 14．原位杂交15．DNA芯片 16．基因诊断17．基因治疗二、选择题A型题：1.限制性核酸内切酶作用特点不包括：A．在对称序列处切开DNA B．DNA两链的切点常不在同一位点C．酶切后产生的DNA片段多半具有粘性互补末端 D．DNA两链的切点常在同一位点E．酶辨认的碱基一般为4～6个2．限制性核酸内切酶：A．可将单链DNA任意切断 B．可将双链DNA序列特异切开C．可将两个DNA分子连接起来 D．不受DNA甲基化影响E．由噬菌体提取而得3．cDNA文库包括该种生物的：A．某些蛋白质的结构基因 B．所有基因组C．结构基因与不表达的调控区 D．内含子和调节区E．内含子和外显子4．下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的：A．从特定组织或细胞中提取mRNAB．将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中C．用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD．用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNAE．加S-腺苷甲硫氨酸（SAM），以使新生的DNA双链甲基化5．限制性核酸内切酶的通常识别序列是：A．粘性末端 B．RNA聚合酶附着点C．回文对称序列 D．聚腺苷酸E．甲基化“帽”结构6．pUC系列是指：A．经人工改造的大肠杆菌质粒 B．天然的大肠杆菌质粒C．天然的酵母质粒 D．经人工改造的大肠杆菌噬菌体E．经人工改造的酵母质粒7．用于转染哺乳类细胞的常用载体是：A．质粒 B．噬菌体C．逆转录病毒RNA D．结构基因E．乳糖操纵子8．转化常指：A．噬菌体感染 B．基因的转位C．摄取外来DNA，引起细胞生物学类型的改变 D．产生点突变E．产生移码突变9．基因工程的操作程序可简单地概括为：A．载体和目的基因的分离、提纯与鉴定 B．分、切、接、转、筛C．将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株 D．将载体和目的基因接合成重组体E．限制性核酸内切酶的应用10．用于基因治疗较为理想的载体是：A．质粒 B．噬菌体C．经改造的逆转录病毒 D．人类DNAE．酵母质粒11．常用质粒有以下特性：A．是线形双链DNA B．插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C．含有抗生素抗性基因 D．含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E．不随细菌繁殖而进行自我复制12．在重组体中切出插入片段最常用的方法是：A．以重组时所用限制性核酸内切酶将其切出 B．用其它限制性酶将其切出C．用S1核酸酶将其切出 D．用DNA酶将切出E．用多种限制性内切酶将其切出13．利用PCR扩增特异DNA序列主要原理之一是：A．反应体系内存在特异DNA片段 B．反应体系内存在特异RNA片段C．反应体系内存在特异DNA引物 D．反应体系内存在特异RNA引物E．反应体系内存在的TaqDNA聚合酶具有识别特异DNA序列的作用14．表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是：A．大肠杆菌表达体系 B．原核表达体系C．酵母表达体系 D．昆虫表达体系E．哺乳类细胞表达体系15．限制性核酸内切酶切割DNA后产生：A．3′-磷酸基末端和5′-羟基末端 B．5′-磷酸基末端和3′-羟基末端C．3′-磷酸基末端和5′-磷酸基末端 D．5′-羟基末端和3′-羟基末端E．3′-羟基末端和5′-羟基末端及磷酸16．下列描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是：A．小型环状双链DNA分子 B．携带有某些抗生素抗性基因C．在细胞分裂时恒定地传给子代细胞 D．具有自我复制功能E．获得目的基因17．在分子生物学领域分子克隆主要是指：A．DNA的大量复制 B．DNA的大量转录C．DNA的大量剪切 D．RNA的大量剪切E．RNA的大量反转录18．在分子生物学领域重组DNA技术又称：A．酶工程 B．蛋白质工程C．细胞工程 D．发酵工程E．分子克隆技术19．在重组DNA技术中不涉及的酶是：A．限制性核酸内切酶 B．DNA聚合酶C．DNA连接酶 D．反转录酶E．DNA解链酶20．多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为：A．平端末端 B．3′突出末端C．5′突出末端 D．粘性末端E．缺口末端21．可识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶为：A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶E．DNA内切酶22．cDNA是指：A．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA B．在体外经反转录合成的与DNA 互补的DNAC．在体外经转录合成的与DNA互补的RNA D．在体外经反转录合成的与RNA 互补的RNAE．在体外经反转录合成的与DNA互补的RNA23．基因组代表一个细胞或生物体的：A．部分遗传信息 B．整套遗传信息C．可转录基因 D．非转录基因E．可表达基因24．在基因工程中通常所用的质粒存在于：A．细菌染色体 B．酵母染色体C．细菌染色体外 D．酵母染色体外E．病毒DNA外25．就分子结构而论质粒是：A．环状双链DNA分子 B．环状单链DNA分子C．环状双链RNA分子 D．线状双链DNA分子E．线状单链DNA分子26．聚合酶链式反应可表示为：A．PEC B．PERC．PDR D．BCRE．PCR27．在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是：A．化学合成法 B．基因组文库法C．cDNA文库法 D．PCRE．差异显示法28．重组DNA的基本构建过程是将：A．任意两段DNA接在一起 B．外源DNA接入人体DNA C．外源基因插入宿主基因 D．目的基因接入适当载体E．目的基因接入哺乳类DNA29．EcoRⅠ切割DNA双链产生：A．平端 B．5′突出粘端C．3′突出粘端 D．钝性末端E．配伍末端30．催化PCR的酶是：A．DNA连接酶 B．反转录酶C．末端转移酶 D．碱性磷酸酶E．TaqDNA聚合酶31．将PstⅠ内切酶切割后的目的基因与用相同内切酶切割后的载体DNA连接属：A．同聚物加尾连接 B．人工接头连接C．平端连接 D．粘性末端连接E．非粘性末端连接32．重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是：A．DNA聚合酶 B．RNA聚合酶C．DNA连接酶 D．RNA连接酶E．限制性核酸内切酶33．以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称：A．转化 B．转染C．感染 D．转导E．转位34．最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是：A．营养互补筛选 B．抗药性筛选C．免疫化学筛选 D．PCR筛选E．分子杂交筛选35．α互补筛选法属于：A．抗药性标志筛选 B．酶联免疫筛选C．标志补救筛选 D．原位杂交筛选E．免疫化学筛选36．下列常用于原核表达体系的是：A．酵母细胞 B．昆虫细胞C．哺乳类细胞 D．真菌E．大肠杆菌37．在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用：A．反转录酶 B．多聚核苷酸激酶C．引物酶 D．RNA聚合酶E．末端转移酶38．在分子生物学领域分子克隆专指：A．细胞克隆 B．RNA克隆C．DNA克隆 D．抗体克隆E．mRNA克隆39．用于重组DNA 的限制性核酸内切酶，识别核苷酸序列的：A．正超螺旋结构 B．负超螺旋结构C．α螺旋结构 D．回文结构E．锌指结构40．在基因工程中通常所用的质粒是：A．细菌染色体DNA B．细菌染色体以外的DNA C．病毒染色体DNA D．病毒染色体以外DNAE．噬菌体DNA41．构建基因组DNA文库时，首先需要分离细胞的：A．染色体DNA B．线粒体DNAC．总mRNA D．tRNAE．rRNA42．DNA连接酶是从T4 噬菌体感染大肠杆菌中分离的，这种连接酶：A．只能催化平末端连接，而不能催化粘性末端连接B．即能催化单链DNA连接又能催化粘性末端双链DNA连接C．双链DNA中不需一条完整的单链D．单链中的切口位点可缺少几个核苷酸E．切口存在相邻的5′-磷酸和3′-羟基末端，使其以磷酸二酯键连接43．末端转移酶是合成酶类：A．作用时不需模板 B．是从小牛胸腺中分离C．能催化单链核苷酸转移到5′-磷酸上 D．需要带有5′-端磷酸的末端的ssDNA E．需要有延伸5′-端磷酸的末端dsDNA44．在基因工程中可用碱性磷酸酶：A．防止DNA的自身环化 B．同多核苷酸激酶一起进行DNA3′-羟基末端标记C．制备突出的3′-末端 D．特异切除DNA或RNA的3′-末端羟基E．水解特异的核苷酸片段45．以下哪种酶作用时需要引物：A．限制性核酸内切酶 B．末端转移酶C．反转录酶 D．DNA连接酶E．碱性磷酸酶46．S1核酸酶的功能是：A．切割双链的DNA B．切割单链的RNA C．切割发夹环 D．切割单链DNA E．以上有两项是正确的47．在cDNA技术中所形成的发夹环可用：A．限制性核酸内切酶切除 B．用3′外切酶切除C．用S1核酸酶切除 D．用5′外切酶切除E．碱性磷酸酶切除48．下面有关限制性内切酶的叙述正确的是：A．限制酶是外切酶而不是内切酶B．限制酶在特异序列（识别位点）对DNA进行切割C．同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的D．一些限制酶在识别位点稍有不同的点切割双链DNA，产生粘性末端E．一些限制酶在识别位点相同的位置切割双链DNA，产生平末端49．限制性核酸内切酶可以特异识别：A．双链DNA的特定碱基对 B．双链DNA的特定碱基序列C．特定的三联码 D．双链RNA的特定碱基序列E．双链RNA的特定碱基对50．DNA聚合酶的主要用途：A．利用它的3′→5′聚合活性，合成ds-DNA第二条链B．对DNA的5′-端进行填补或末端标记C．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ用于缺口平移，制作DNA标志探针D．DNA聚合酶Ⅱ可用于DNA测序E．TaqDNA聚合酶用于PCR51．反转录酶：A．是依赖于DNA的RNA聚合酶 B．用于真核DNA反转录生成mRNA C．用于RNA探针的制备 D．用于RNA序列测定E．是依赖于RNA的DNA聚合酶52．基因工程中作为载体应具备以下特点：A．能在宿主细胞中复制繁殖 B．容易进入宿主细胞C．具有多克隆位点 D．容易从宿主细胞中分离出来E．以上均是53．下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大：A．质粒 B．粘粒C．酵母人工染色体 D．λ噬菌体E．cDNA表达载体54．pUC是一种改造型质粒，含有：A．乳糖操纵子调节基因、启动子 B．多克隆位点C．lacZ′基因 D．氨苄青霉素抗性基因E．以上均有55．质粒具有以下特点：A．是位于细菌染色体外的RNA B．不能自主复制C．为单链环形DNA D．大小在2～300kb之间E．以上都不对56．粘粒是一种人工建造的载体不具有以下特点：A．可借cos位点将多个粘粒串联成大环 B．本身约4～6kb之间C．进入受体细胞后可进行复制 D．可克隆DNA大片段E．以上都不是57．下面关于多克隆位点的描述不正确的是：A．仅位于质粒载体中 B．具有多种限制性内切酶识别的位点C．不同酶的识别序列可以重叠 D．一般是人工合成后添加到载体中E．可位于不同载体中58．下列筛选重组体的方法中不属于遗传学方法的是：A．限制性内切酶图谱法 B．PCRC．Northern印迹法 D．Southern印迹法E．抗药性标记基因59．利用基因工程可以进行：A．建立染色体基因文库 B．分析基因的结构与功能C．疾病的发生、发展及治疗的分子机制 D．疾病的诊断和基因治疗E．以上均可以60．Southern印迹的DNA探针杂交：A．只与序列完全相同的RNA片段 B．可与任何含有相同序列的DNA片段C．可与任何含有互补序列的DNA片段 D．可与用某些限制性核酸内切酶切成的DNA片段E．只与含有互补序列的RNA片段61．下列哪个不是Southern印迹法的步骤：A．用限制性核酸内切酶消化DNA B．DNA与载体连接C．用凝胶电泳分离DNA片段 D．DNA片段转移至硝酸纤维素膜上E．用一个标记的探针与膜杂交62．下列哪个不是Northern印迹法的步骤：A．从细胞和组织中提取RNA B．用凝胶电泳分离RNAC．将RNA转移到支持物上 D．与核酸探针进行杂交E．将RNA反转录合成DNA63．原位杂交具有以下特点：A．不需从组织或细胞中提取核酸 B．对靶序列有很高的灵敏度C．可完整保护组织与细胞的形态 D．准确反映出组织细胞的相互关系及功能状态E．以上均是64．下列哪项不是探针的特点：A．要加以标记 B．应是双链DNAC．只与靶核酸序列杂交 D．探针长度可以是十几个碱基到几千个碱基不等E．高灵敏度65．探针的种类包括：A．基因组DNA探针 B．cDNA探针C．寡核苷酸探针 D．RNA探针E．以上均是66．下面哪一步不是获得基因组DNA探针的步骤：A．从基因组文库筛选得到特定基因 B．克隆、扩增C．纯化 D．连入表达载体E．切取插入片段67．RNA探针具有以下特点，但除外：A.采用反转录方法可以得到 B．单链、杂交效率高C．杂交体系稳定 D．不存在高度重复序列E．特异性高68．下面哪一步不是cDNA探针的步骤：A．从相应组织细胞直接中分离特异的cDNA B．从相应组织细胞中分离特异的mRNA C．反转录合成cDNA D．与载体连接E．切割cDNA，分离纯化69．常用的标记物有，但除外：A．放射性核素 B．生物素C．荧光素 D．地高辛E．NTP70．用于标记核酸探针的放射性核素主要有，但除外：A．32P B．35SC．3H D．125IE．14C71．放射性核素标记物具有，但除外：A．检测时间短 B．灵敏度和特异性高C．可检出样品少于1000个分子的核酸量 D．半衰期短，稳定性差E．污染环境72．非放射性核素标记物包括，但除外：A．生物素 B．地高辛C．荧光素 D．酶E．核酸73．非放射性核素标记物具有，但除外：A．灵敏度高于放射性核素 B．稳定C．经济 D．实验周期短E．安全、无污染74．PCR反应体系包括，但除外：A．基因组DNA（模板） B．引物C．dNTP D．TaqDNA聚合酶E．T4DNA连接酶75．PCR技术主要应用于：A．目的基因的克隆 B．基因表达与调控C．DNA微量分析 D．遗传病与传染性疾病的诊断E．以上均可以76．以DNA为模板的PCR反应，具备以下条件：A．反应体系一般选用50-100μl B．引物、TaqDNA聚合酶C．4种dNTP、模板DNA D．缓冲液E．以上均是77．以mRNA为模板的PCR反应，具备以下条件：A．需将mRNA反转录生成cDNA B．反应体系一般选用20μl体积、4种dNTP、引物C．需要RNA酶抑制剂、反转录酶 D．TaqDNA聚合酶E．以上均是78．关于PCR停滞的原因，取决于很多因素，但除外：A．样品模板的拷贝数 B．PCR扩增效率C．DNA酶种类及活性 D．dNTP的大量消耗E．非特异性的竞争因素79．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性核素标记的：A．核糖体 B．RNAC．抗体 D．抗原E．以上都不是80．Southern印迹是用DNA探针检测DNA片段，而Northern印迹则是：A．用RNA探针检测DNA片段 B．用RNA探针检测RNA片段C．用DNA探针检测RNA片段 D．用RNA探针检测蛋白片段E．用DNA探针检测蛋白片段81．用免疫化学筛选重组体的原理是：A．根据外源基因的表达 B．根据载体基因的表达C．根据mRNA与DNA的杂交 D．根据DNA与DNA的杂交E．根据RNA与RNA的杂交82．原位杂交包括：A．转膜杂交 B．斑点杂交C．菌落杂交或噬菌斑杂交 D．直接对染色体或组织的杂交E．以上均有83．外源性DNA进入菌体的方式是：A．转化 B．转录C．翻译 D．半保留复制E．以上都不是84．要将无粘性末端的两种平端DNA片段结合在一起，可在：A．两种片段上都接上聚（dT）尾部 B．一种片段接聚（dT）尾部，另一种接聚（dA）尾部C．两种片段都接上聚（dA）尾部 D．反应液中加以T4DNA连接酶E．有两项是对的85．用原核生物表达真核生物的基因存在的问题是：A．大肠细菌只能表达克隆的cDNA B．细菌不能切除原始转录物中相当于内含子的核苷酸序列C．缺乏翻译后加工机制 D．表达的蛋白质常形成不溶性包涵体E．以上都正确86．常用载体有：A．质粒 B．噬菌体C．病毒DNA D．大肠杆菌基因组DNAE．有3项是正确的87．构建cDNA文库时，首先需分离细胞的：A．染色体DNA B．线粒体DNAC．总mRNA D．tRNAE．rRNA88．构建DNA文库时，首先需分离细胞的：A．染色体DNA B．线粒体DNAC．总mRNA D．tRNAE．rRNA89．设计PCR的引物时，应考虑引物与模板的：A．5ˊ端特定序列互补 B．5ˊ端任意序列互补C．3ˊ端特定序列互补 D．3ˊ端任意序列互补E．中间序列互补90．用于鉴定转化子细胞是否含重组DNA的最常用方法是：A．抗药性选择 B．分子杂交选择C．RNA反转录 D．免疫学方法E．体外翻译91．下列哪一步是DNA芯片技术的最关键的环节：A．样品的准备与标记 B．芯片的制备C．信号的检测 D．数据分析处理E．杂交92．基因诊断常用的技术方法有：A．核酸分子杂交 B．单链构象多态性分析C．DNA序列测定 D．DNA芯片技术E．以上均是B型题：A．基因从原来位置转到基因组的另一位置 B．噬菌体或病毒DNA进入细胞中繁殖C．外来DNA引起细胞生物学特性的改变 D．移码突变 E．非移码突变1．感染是指：2．转化是指：3．转位是指：4．结构基因中3个核苷酸的插入或丢失是指：5．结构基因中1个核苷酸的插入或丢失是指：A．抗药性选择 B．分子杂交选择 C．RNA转录 D．免疫学方法 E．体外翻译6．用于鉴定是否有质粒转入受体菌的一般方法是：7．用于鉴定转化子细胞是否含目的基因的常用方法：8．利用目的基因表达产物的特异抗体来筛选含目的基因的转化子细胞的方法是：A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．反转录酶 D．TaqDNA聚合酶 E．碱性磷酸酶9．识别DNA回文结构并对其双链进行切割的是：10．用于聚合酶链式反应的是：11．将目的基因与载体DNA进行连接的酶是：12．特异切除DNA或RNA5ˊ端磷酸的酶是：13．mRNA转录合成cDNA的酶是：A．支原体 B．衣原体 C．噬菌体 D．细菌 E．酵母14．常用作原核表达体系的是：15．常用作真核表达体系的是：A．基因组文库 B．cDNA文库 C．mRNA文库 D．tRNA文库 E．rRNA 文库16．分离细胞染色体可制备：17．分离细胞总mRNA可制备：A．抗药性选择 B．RNA反转录 C．免疫化学方法 D．体外翻译E．PCR18．对重组体内基因进行直接选择的方法是：19．通过鉴定基因表达产物筛选重组体的方法是：A．RNA聚合酶 B．末端转移酶 C．碱性磷酸酶 D．反转录酶 E．核苷酸酶20．切除DNA末端磷酸基需要用：21．在DNA3′羟基末端进行同聚物加尾需要用：22．合成cDNA需要用：A．同聚物加尾连接 B．人工接头 C．粘性末端连接 D．缺口末端连接 E．平端连接23．外源基因和载体DNA经限制性酶切后的连接属于：24．在外源基因和载体DNA末端添加同聚物序列后再进行连接属于：25．在外源基因和载体DNA末端添加短核苷酸序列，人为制造粘性末端再进行连接属于：26．需用适当的酶将DNA突出末端削平或补齐的连接属于：A．将单链DNA任意切断 B．将双链DNA序列特异切开 C．将两个DNA分子连接起来D．将缺口末端连接 E．切除DNA末端磷酸基团27．限制性内切酶的作用是：28．DNA连接酶作用是：29．碱性磷酸酶作用是：A．某些蛋白质的结构基因 B．所有基因结构 C．不表达的调控区D．内含子和调节区 E．外显子和调节区30．cDNA文库包括：31．DNA文库包括：32．真核mRNA包括：A．DNA聚合酶 B．RNA聚合酶 C．DNA连接酶D．RNA连接酶 E．限制性核酸内切酶33．切除特异DNA片段：34．连接两个DNA片段：35．大量扩增DNA片段：A．反转录酶 B．多聚核苷酸激酶 C．引物酶 D．RNA聚合酶 E．末端转移酶36．催化ATP的磷酸转移到DNA或RNA的5ˊ端羟基上：37．催化单核苷酸转移到DNA的3ˊ端羟基上：38．合成cDNA：C型题：A．将含有目的基因的噬菌体感染细菌 B．将含有目的基因的质粒导入细菌进行表达C．两者都是 D．两者都不是1．转化：2．感染：A．cDNA文库 B．基因组文库 C．两者都是 D．两者都不是3．含内含子：4．含结构基因：A．将含有目的基因的噬菌体感染细菌 B．将含有目的基因的质粒导入细菌进行表达C．两者都是 D．两者都不是5．转化：6．转位：A．cDNA文库 B．基因组文库 C．两者都是 D．两者都不是7．含转录调控区：8．较易表达：A．cDNA文库 B．基因组文库 C．两者都是 D．两者都不是9．制备目的基因可在真核生物体系中表达：10．几乎含有人的全部基因：A．cDNA文库 B．基因组文库 C．两者都是 D．两者都不是11．具有组织特异性：12．可在原核生物体系中表达：A．光介导原位合成 B．压电打印合成 C．两者都是 D．两者都不是13．原位合成芯片：14．DNA微集阵列：A．喷墨打印 B．针式打印 C．两者都是 D．两者都不是15．原位合成芯片：16．DNA微集阵列：A．光介导原位合成 B．喷墨打印 C．两者都是 D．两者都不是17．原位合成芯片：18．DNA微集阵列：A．压电打印合成 B．针式打印 C．两者都是 D．两者都不是19．原位合成芯片：20．DNA微集阵列：A．DNA序列测定 B．突变分析 C．两者都是 D．两者都不是21．DNA芯片技术可用于：22．PCR技术可用于：A．基因表达 B．DNA的微量分析 C．两者都是 D．两者都不是23．DNA芯片技术可用于：24．PCR技术可用于：A．药物研究 B．基因诊断 C．两者都是 D．两者都不是25．PCR技术可用于：26．核酸分子杂交：A．目的基因克隆 B．基因结构研究 C．两者都是 D．两者都不是27．DNA芯片技术可用于：28．PCR技术可用于：A．DNA与DNA的杂交 B．DNA与RNA杂交 C．两者都是 D．两者都不是29．Southern印迹杂交：30．斑点杂交：A．DNA与RNA杂交 B．DNA与DNA的杂交 C．两者都是 D．两者都不是31．原位杂交：32．Northern杂交：A．遗传性疾病的诊断 B．感染性疾病的诊断 C．两者都是 D．两者都不是33．分子杂交技术可用于：34．PCR技术可用于：A．肿瘤 B．个体鉴别 C．两者都是 D．两者都不是35．PCR技术可用于：36．DNA芯片技术可用于：三、问答题1．简述基因工程的主要过程。

第11章基因工程新技术

第11章基因工程新技术
第11章基因工程新技术
1998年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重 组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极 低：约40bp。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着 该技术的应用，出现了一个新的术语：
Recombineering (recombination-mediated genetic engineering) is a genetic and molecular biology technique based on homologous recombination systems in E. coli and other bacteria mediated by phage proteins, either RecE/T from Rac prophage or Red alpha/beta/gamma from bacteriophage lambda
中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA 分子, 另一端只 可容纳单链DNA 。Exo 蛋白可结合在双链DNA 的末端,从DNA 双链的5′端向3′端降解DNA ,产生3′突出端。(RecE) Beta 蛋白是一种退火蛋白, 自发地形成环状结构(12–18 subunits per ring),,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA 被单链核酸 酶降解,同时介导互补单链DNA 的退火 ,双链DNA退火完成 后,Beta 蛋白从DNA 双链上解离下来。Beta 蛋白在Red 同源重组 过程中起着决定性的作 (RecT) Gam 蛋白可与RecBCD 结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外 源DNA 的降解 。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重 组。
Step 1
cat
sacB

基因工程技术ppt课件

基因工程技术ppt课件
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
17
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
18
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19

基因工程精选全文完整版

基因工程精选全文完整版
成mRNA，并最终以蛋白质的形式 在宿主细胞中表达 原核表达载体：有两类
– 可直接表达不含任何原核序列的外源 蛋白（原核表达载体）
– 以融合蛋白的形式进行表达（原核基 因融合表达载体）
表达载体
真核表达载体含有：
– 原核基因序列 – 真核转录单位
真核表达载体：有两类
– 不带病毒复制子 – 带病毒复制子
质粒（plasmid）
存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息
质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型
松弛控制型
(stringent control) (relaxed control)
基因工程操作流程
基因重组示意图
基因工程上游技术基本过程
选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
载体（vector）
质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）
载体的条件
分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志
法将允许克隆人体器官
法国总理若斯潘（2000年9月28日） 表示：
– 法国政府将允许对人体器官克隆技术 进行用于医疗目的的研究
基因工程技术
上游技术（upstream）
– 重组子的构建 – 工程菌的构建及高效表达
下游技术（downstream）
– 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 – 新型生物反应器的研制 – 高效分离介质及装置的开发 – 分离纯化的优化控制 – 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 – 超滤、反渗透技术的应用

第十一章生物技术与工程课时4动物细胞工程-2025年高考生物备考教案

第十一章生物技术与工程课时4动物细胞工程-2025年高考生物备考教案

课时4动物细胞工程课标要求核心考点五年考情核心素养对接1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。

动物细胞培养是动物细胞工程的基础；2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程；3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程；4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术；5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值动物细胞培养和干细胞的应用2023：辽宁T7、海南T7、湖南T21（4）；2022：海南T20（1）（3）（4）、湖北T7、江苏T14；2021：湖南T22（2）、重庆T5、浙江1月T18；2020：江苏T231.生命观念——深入理解动物细胞核移植和克隆技术，理解生命的发生、发展过程。

2.科学思维——分析动物细胞培养的条件、细胞融合和单克隆抗体制备的原理，形成科学思维的习惯。

3.科学探究——通过动物细胞培养操作，培养科学探究能力。

4.社会责任——了解生物工程技术在生产上的应用，认同生物技术对社会发展的影响，承担应有的社会责任动物细胞融合技术和单克隆抗体2023：北京T12、湖北T22（1）（2）（3）；2022：浙江1月T29（二）（3）、辽宁T24Ⅱ、江苏T19、山东T15；2021：山东T15；2020：江苏T28（4）、全国ⅠT38；2019：江苏T23动物体细胞核移植技术和克隆动物2023：天津T7；2021：辽宁T13、湖南T22（3）；2020：天津T1命题分析预测1.高考对本部分的考查常以生产或科研实践为情境，也可以图为载体，主要考查动物细胞培养、动植物细胞融合的异同、单克隆抗体的制备等，既有选择题，也有非选择题。

2.预计2025年高考仍可能延续往年的考查形式及特点，与基因工程、胚胎工程等其他知识相结合进行命题考点1动物细胞培养和干细胞的应用学生用书P3331.动物细胞培养（1）动物细胞培养的原理、条件和过程辨析细胞贴壁和接触抑制（1）细胞贴壁是指体外培养的细胞贴附在培养瓶的瓶壁上生长的现象；接触抑制是指当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。

陈阅增普通生物学习题111

陈阅增普通生物学习题111
5、光合作用过程中，氧气在暗反应中被释放。（）
三、选择
1、下列不是高等植物叶绿体中光合色素的是：
A、叶绿素B、叶黄素C、花青素D、胡萝卜素
2、光合作用中效率最差的是（）光：
A、紫B、绿C、白D、黄
四、问答
什么光合作用？主要的光合自养生物有哪些？
第六章生物的营养
一、选择题：
1、“肥料三要素”是指（）。
A、慢跑B、激烈奔跑C、产生的能量同样高D、无法判断
第五章光合作用和合成作用
一、名词生物固氮
二、判断
1、光合作用中释放的氧气来自CO2
2、植物体在白天进行光合作用，在夜晚进行呼吸作用，两者循环交替发生。( )
3、植物光合作用的光反应发生在叶绿体的基质中，而暗反应则发生在类囊体膜上。（）
4、根据在光合作用中作用的不同，光合色素可分为作用中心色素和聚光色素。（）
2、太阳质量约是地球质量的33倍（）。
3、地球是太阳系唯一存在生命的行星（）。
4、只有在液态水和含碳有机化合物都存在的行星上才有可能存在生命（）。
5、大陆漂移引起地球地表发生了沧海桑田的变化（）。
三、简述：1、“化学进化学说”的主要内容
2、早期单细胞生物的进化历程
第三章细胞
一、名词
原生质、
组织、
细胞凋亡、
3、用未知基因型的显性个体与纯合隐性个体杂交称为测交。（）
4、孟德尔用豌豆做实验发现了分离和自由组合定律，可见连锁交换定律不适用与豌豆的性状遗传。（）
5、鸡的性别决定是ZW型，公鸡的性染色体为两个异型的ZW（）
三、选择
1、等位基因的互作不包括：（）
A、共显性B、镶嵌显性C、不完全显性D、上位作用
四、问答
四、问答

基因工程课件

基因工程课件

节能减排：利用 基因工程技术， 培育出能够高效 利用能源、减少 废气排放的微生 物，促进节能减 排。
保护生物多样性： 通过基因工程手 段，保护濒危物 种，维护生物多 样性，促进生态 系统的稳定和可 持续发展。
04
基因工程的安全性与伦 理问题
基因工程的安全性问题
基因治疗中可能出现的免疫 排斥反应
基因编辑技术可能带来的脱 靶效应
生物仿制药的研发与市场前景
农业改良
提高农作物的产量和品质 培育抗病、抗虫、抗旱等新品种 实现精准农业和智能化农业 促进农业可持续发展
生态环保
减少农药使用： 通过基因工程培 育抗病、抗虫的 农作物，减少农 药的使用，降低 对环境和人体的 危害。
治理污染：通过 基因工程技术， 将污染物降解的 酶基因导入微生 物中，实现对污 染物的生物降解 和治理。
基因工程是一种基于分子遗传学的技术 通过改变生物体的遗传物质来实现对生物性状的改良 基因工程的基本操作步骤包括基因克隆、基因表达和基因编辑 基因工程在医学、农业、工业等领域有着广泛的应用
基因工程的发展历程
基因工程的起源
基因工程的发展阶段
基因工程的应用领域
基因工程的前景展望
基因工程的应用领域
疾病治疗
基因治疗：通 过改变或修复 基因来治疗疾
病的方法
基因药物：利 用基因工程技 术生产能够治 疗疾病的蛋白
质药物
基因检测：通 过检测基因变 异来预测疾病 风险和指导治
疗
基因疫苗：利 用基因工程技 术生产的疫苗
来预防疾病
生物制药
基因工程在生物制药中的应用
重组蛋白药物的生产
基因治疗和细胞治疗的发展
违反法规的后果 与处罚措施
05

基因工程第一章植物基因工程原理与技术完整PPT

基因工程第一章植物基因工程原理与技术完整PPT

2、基因工程的应用和发展
农业应用
应用重组技术培育具有改良性状的粮食作物的工作 已初见成效。这方面工作按照发展水平可以分为三 个不同的阶段：
（1）主要集中于有重要农业经济意义的目的基因的分离与改造 （2）主要目标是培育出具有改良有重要经济性状的工程植株 （3)发展方向是培育出具有生物反应器功能的工程植株
展开竞争。 1998年12月 一种小线虫完整基因组序列的测定工作宣告完成，这是科学家第一次绘
出多细胞动物的基因组图谱。
二、基因工程的发展历史
1999年9月 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的 1%。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与国， 也是参与这一计划的惟一发展中国家。
4、基因克隆需要特殊的工具和技术
运输工具：
– 细菌质粒 – 病毒染色体
DNA操作技术
– 纯化DNA – 剪切DNA分子
分析DNA片段大小
– 连接DNA分子 – 将DNA转入受体细胞 – 重组子的鉴定
2、基因工程应用研究
基因工程已在医药业、农牧业、食品 工业、环境保护、能源开发等领域 重到了广泛的应用
验的转基因植物就有1467例， 又过4年，至1998年4 月已达4387项。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因工程迅速发展阶段
如果说20世纪80-90年代是基因工程基础研 究趋向成熟，应用研究初露锋芒的阶段
那么，21世纪初将是基因工程应用研究的 鼎盛时期，农林牧渔医的很多产品都会 打上基因工程的标记
三、基因工程的研究内容
基础研究 应用研究
1953年 美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。 1969年 科学家成功分离出第一个基因。 1980年 科学家首次培育出世界第一个转基

基因工程与生物技术应用

基因工程与生物技术应用
利用生物技术生产可生物降解的塑 料材料，减少传统塑料对环境的污 染。
生物能源
利用生物技术转化生物质为生物燃 料，如生物柴油和生物乙醇等，为 可再生能源领域提供新的发展方向 。
环保领域应用
污水处理
利用生物技术处理污水中的有害物质，提高污水 处理的效率和质量。
大气净化
通过生物技术减少大气中的污染物排放，如利用 微生物降解大气中的有毒气体。
02
基因工程技术与方法
DNA重组技术
限制性内切酶与DNA连接酶
利用限制性内切酶切割DNA，再通过DNA连接酶连接不同来源的DNA片段，实现DNA重 组。
载体构建与转化
将外源DNA片段插入到载体DNA中，构建成重组DNA分子，再将其导入特异性探针或PCR技术筛选目的基因。
生命起源与基因编辑
基因编辑技术如CRISPR-Cas9允许对生物体基因进行精确 编辑，这引发了对生命起源和干预生命自然过程的伦理争 议。
动物福利与基因工程
在农业和医学研究中，基因工程常被用于改良动物品种。 然而，这可能导致对动物福利的忽视，引发伦理道德问题 。
法规政策问题探讨
监管框架
基因工程和生物技术的快速发展要求建立相应的法规和政策框架来 确保其安全、有效和道德的应用。
基因突变技术
利用物理、化学或生物方法诱导基因 突变，产生新的基因型和表现型。
基因敲除与敲入技术
通过基因编辑技术敲除或敲入特定基 因，研究基因功能或构建疾病模型。
基因编辑技术
利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术对 目标基因进行定点编辑，实现基因功 能的改变或修复。
基因组学技术
基因组测序技术
利用高通量测序技术对生物体基因组进行全面测序，揭示基因组 的结构和功能。
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

Cre重组酶催化位点：loxP位点
当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以
发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题 loxp 位点的点突变 ：突变点
Cre酶无法有效识别
降低基因丢失几率
：突变点
loxp 位点的点突变
Cre酶无法有效识别
实现稳定的基因颠倒
或者采用类似于λred系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达
marker
gene A gene A
marker
tag sequence loxP/FRT sequence C terminal sequence (no translation stop signal )
molecular cloning free
A single chromosomal FRT site becomes the substrate for recombination with FRT-containing replication-deficient plasmids that carries lacZ and lacY, designed in such a way to create either a transcriptional or translational fusion to the promoter of interest.
Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution Nature 460, 894-898
IV 染色体大片段复制
2
marker
marker
复制染色体上的基因：加入PCR产物，引物设计时上游引物与目标基因下 游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体 断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。 引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出MARKER 应用该技术可复制长达1Mbp的序列。
λ 噬菌体 P O P’
包装
感染宿主
P O P’ × B O B’ Int Int IHF IHF Xis P O B’
B O P’
λ 噬菌体的整合和切离
两边为13bp反向重复序列，中间位8bp非对称核心序列
（1） 重组机理

loxP loxP
loxP
loxP

如果一个DNA分子上 两个特异位点之间发 生重组，其后果有两 种可能性：两个位点 之间的片段或丢失， 或被颠倒 生物能够利用这种重 组倒臵来控制基因的 表达因为DNA的一正 一倒两种排列法可以 相应地表达两种不同 的蛋白质，细胞就可 根据需要作出选择。
2. 位点特异性重组系统及其应用
位点特异性重组
重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。
位点特异性重组与同源重组的区别
重组位点限制： 有
同源序列的长短：短 重组酶的专一性：有 重组效率： 高达100%
常见的位点特异性重组系统
λ噬菌体系统：λ噬菌体编码λ整合酶（integrase，Int 重组酶，不可逆 ）、 来自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）、切除酶 （excisionase ） P1噬菌体系统: Cre重组酶（可逆） 2 m质粒系统：FLP重组酶（可逆） 链霉菌噬菌体 C31系统 （不可逆） 均可广泛应用于真核细胞中
细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段.
E. coli 自身的同源重组系统主要包括： RecBCD, RecE, RecF系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：1–2 kb。 最主要的重组系统RecBCD在 dsDNA 同源区为 50–100 kb ( 通过接合转移和转导) ，才能高效重组。经修饰过的 RecBCD及 RecA 系统能在 Chi 位点 (crossover hotspot instigator, GCTGGTGG)高效重组，同源区段长度一般不 低于5kb，重组需要DNA片段两端有同向的CHI位点。如果 人工构建这样的片段， 其重组几率为10-5
λRed/ET recombination systems are highlighted by their ability to cross PCR-generated substrates bearing small regions of homology to the target gene (40–50 bp) into bacterial chromosomes, allowing bacterial geneticists to perform PCR-mediated gene replacement
转化PCR片段，培养2h后涂布抗性平板，高温培养
II 结合反向筛选进行基因替换
正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。 反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克 隆正常生长
例：cat正筛选标记，sacB负筛选标记
cat sacB gene A
Medium
Step 1
cat
sacB
chloramphenicol
gene A Mutant
Step 2
cat
sacB
gene A Mutant
基因 敲除
sucrose
重叠延伸PCR
Gene inversion（small fragment)
cat
gene A
sacB
Step 1
cat sacB
gene A
第11章 基因工程新技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用 2. 位点特异性重组系统及其应用 3. 基因打靶 4. 基因抑制技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用
早在1990s, 研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源
重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以 方便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。
MMR (specifcally remove the oligodirected base change)系统缺陷株中，重组效 率会提高2个数量级，可高达25%！这意味着 不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替 换、插入或缺失。
mutS:Methyl-directed Mismatch Repair
位点特异性重组
例：植物中染色体大片段的缺失
gusA： 编码β-葡(萄)糖 苷酸酶，报告基因 Ds:植物转座子
marker1 FRT/loxP
marker2 FRT/loxP
marker1
marker2
染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞 的两个位点之间序列颠倒。 基因融合


λ Red 系统的重组效率约比 RecET系统高3倍。
(2) 主要应用
需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底 表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温 敏性质粒，可在高温下被消除。
I 基因敲除及markerfree操作（需结合位点特异性重组技术）
PCR产物扩增
诱导培养含pKD46大肠杆菌
（2）主要应用
I 利用位点特异性重组控制转入基因的表达
loxP loxP
将一个序列臵于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元＋loxP序列） 阻遏基因的表达 将e基因臵于诱导启动子控制之下，控制Cre 重组酶的表达，从而控制 目标基因的表达
II 条件缺失突变体的构建
在目标基因的两侧引入特异性重组位点 将cre基因臵于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控
(1) λ Red 系统 及 rac 噬菌体的 RecET系统的原理 ★
Red 系统包括3个基因: exo, bet 和 gam

exo 基因编码λ 核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子, 中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA 分子, 另一端 只可容纳单链DNA 。Exo 蛋白可结合在双链DNA 的末端,从DNA 双链的5′端向3′端降解DNA ,产生3′突出端。(RecE) Beta 蛋白是一种退火蛋白, 自发地形成环状结构(12–18 subunits per ring),,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA 被单链核酸 酶降解,同时介导互补单链DNA 的退火 ,双链DNA退火完成 后,Beta 蛋白从DNA 双链上解离下来。Beta 蛋白在Red 同源重组 过程中起着决定性的作 (RecT) Gam 蛋白可与RecBCD 结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外 源DNA 的降解 。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重 组。
启动子+完整orfA: 复制 orfA的5’端或中间区域：失活
orfA的3‘端区域：对基因A表 达无影响，在染色体上多了一 个不完整的orfA拷贝（缺5’端）
制之下，在某种条件下使Cre 重组酶表达，从而缺失目标 基因
优点：同源重组造成“完全的”基因敲除，而同源重组和位点特异性 重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如 可以研 究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表 达。
要避免Cre 重组酶的背景活性
III 利用位点特异性重组进行染色体工程
marker FRT/loxP FRT/loxP marker1 FRT/loxP
marker FRT/loxP
marker2 FRT/loxP
FRT/loxP
大肠杆菌中采用该方式一次性 删除117- 165-kbp片段，效率 100%
Marker free操作，但不属于无痕 操作，每次重组留下一个疤痕， 造成极性效应，多影响下游基因 表达。多个疤痕对后续操作也有 不利影响