丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏微板法)

丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒（速率法）说明书[产品名称] 通用名称: 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒（速率法）英文名称:L-Alanine Aminotransferase Assay Kit（ALT）[包装规格]2×200Tests；2×400Tests；R1:4×60ml、R2:4×15ml；R1:4×80ml、R2:4×20 ml；R1:4×120ml、R2:2×60ml；R1:8×40ml、R2:2×40ml；R1:4×50ml、R2:2×25 ml；R1:2×40ml、R2:2×10ml；R1:4×50ml、R2:4×25ml。

[预期用途] 用于体外定量检测人血清中的丙氨酸氨基转移酶的活力。

[检验原理]ALTL-丙氨酸 +α-酮戊二酸丙酮酸+ L-谷氨酸LDH丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ + H2O[主要组成成份]由试剂R1和试剂R2组成。

试剂R1：三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、乳酸脱氢酶（LDH）、L-丙氨酸、α-酮戊二酸；试剂R2：三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、还原型辅酶（NADH）。

[储存条件及有效期] 试剂在2℃～8℃无腐蚀性气体中避光储存，若无污染，可稳定至失效期。

有效期12个月。

开瓶后2℃～8℃可稳定30天。

备注：生产日期及失效日期见外盒或瓶标签。

[适用仪器]日立7170、奥林巴斯AU640、贝克曼LX-20全自动生化分析仪。

[样本要求]使用新鲜的无溶血血清，血清不宜反复冻融，以免影响酶活性。

[检验方法]（1）双试剂无需配制，直接使用。

（2）试验条件：样本（S）：15 µl试剂1(R1) ：200 µl 试剂2（R2）：50 µl温度：37 ℃测定类型：速率法主波长：340 nm 副波长：405 nm 反应方向：下降方法：先将样本与R1混合，37 ℃5分钟后加入R2试剂，然后测定加入R2后2分钟至4分钟之△A/min 。

丙氨酸氨基转移酶测定试剂（ALT）（酶法）1. 检测原理本试剂采用国际临床化学联合会（IFCC）推荐方法：丙氨酸+α-酮戊二酸−−→−ALT丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+−−→−LDH L-乳酸+NAD++H2ONADH氧化成NAD+引起340nm处吸光度的下降，下降速率与样品中ALT活性成正比。

2．标本采集与处理2.1 受检者的准备：病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。

体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。

注意有无应用影响测试项目的药物。

此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。

应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。

2.2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。

体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。

在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。

2.3 抗凝剂：血浆使用肝素或EDTA（1mg/mL）作为抗凝剂2.4 标本的处理和储存：1血标本室温放置30min～45min后离心分离血清，置洁净试管加盖低温保存。

2标本在2-8℃可稳定3天，避免溶血。

3．试剂3.1 试剂及配套品：3.1.1试剂：本科使用重庆中元生物技术有限公司ALT试剂盒，为液体双试剂，各组分如下：试剂R1：Tris缓冲液NADH 100mmol/L 0.3mmol/L试剂R2：Tris缓冲液100mmol/Lα-酮戊二酸85mmol/LL-丙氨酸 800mmol/LLDH ≥8.5kU/L不同批号试剂盒中各组份不能互换。

3.1.2配套品：无配套品。

3.2 试剂的稳定性：1.原包装试剂储存在2-8℃至标签所示失效日期。

试剂的有效期为12个月。

2.试剂开瓶后，在仪器中至少可保存30天4：校准4.1校准血清：朗道复合校准品4.2校准方式：使用去离子水与校准血清两点定标。

1. 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的原理和方法。

2. 学会操作赖氏法测定ALT活性的实验步骤。

3. 熟悉ALT测定的临床应用及注意事项。

二、实验原理赖氏法是一种常用的酶偶联速率法，用于测定血清中ALT活性。

该方法利用ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸在磷酸盐缓冲液中进行反应，生成L-丙酮酸和α-酮戊二酸，同时NADH被氧化为NAD+。

在特定波长下，NADH的吸光度与ALT活性呈线性关系，通过测定吸光度变化，计算出ALT活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本（2）赖氏法ALT测定试剂盒（3）磷酸盐缓冲液（4）L-丙氨酸（5）α-酮戊二酸（6）NADH（7）NAD+（8）分光光度计2. 实验仪器：（1）恒温水浴箱（2）移液器（3）离心机（4）微量滴定板1. 样本处理：取血清样本，按照试剂盒说明书进行稀释。

2. 标准曲线制备：（1）取6个微量滴定板，分别加入不同浓度的标准ALT溶液。

（2）向每个板中加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀。

（3）加入一定量的L-丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。

（4）将滴定板放入恒温水浴箱中，设定反应时间。

（5）反应结束后，加入一定量的NADH和NAD+，混匀。

（6）在特定波长下测定吸光度，以ALT浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样本测定：（1）按照标准曲线制备的步骤，向微量滴定板中加入血清样本。

（2）按照标准曲线制备的步骤，进行反应和测定吸光度。

（3）根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性。

五、结果与分析1. 标准曲线制备：根据标准曲线，得出线性方程为y=0.0068x+0.0015，其中y为吸光度，x为ALT浓度。

2. 样本测定：根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性为40 U/L。

六、讨论1. 赖氏法测定ALT活性的原理和步骤简单，操作方便，准确度高。

2. 实验过程中，要注意反应时间的控制，以保证反应充分进行。

3. 标准曲线的制备是实验的关键环节，要确保标准曲线的线性关系良好。

丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（IFCC法）【预期用途】该试剂盒采用IFCC法，用于体外定量测定人血清或肝素血浆中丙氨酸氨基转移酶的活力。

【检验原理】在ALT催化下，从丙氨酸转移到2个氨基到α-酮戊二酸上，生成产物谷氨酸和丙酮酸。

后者通过乳酸脱氢酶催化下转变成乳酸，在340nm波长条件下检测到NADH吸光度下降速率，与ALT的活力成比例。

L-ALT丙酮酸+ L-谷氨酸+LDH L-乳酸+NAD++H2O【主要组成成份】R1：Tris缓冲液150mmol/LL-丙氨酸750 mmol/L乳酸脱氢酶（LDH） 1200U/LNADH 0.4mmol/LR2：α-酮戊二酸90mmol/LNADH 0.9mmol/L*不同批号试剂盒各组分请勿混用。

【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2℃~8℃保存有效期为一年。

试剂开瓶后应避光保存，在2℃~8℃可稳定28天。

试剂不可冰冻。

【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪。

若需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。

建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。

【样本要求】新鲜血清或肝素血浆样本，采集后及时测定，应避免污染。

【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件波长340nm温度37℃分析类型动力学法反应方向下降反应操作步骤* ΔA/min=ΔA/min样本管—ΔA/min空白管* 试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。

校准校准品类型S1：生理盐水S2：迈瑞配套校准品推荐进行2点线性校准校准周期和要求（包括但不限于以下情况）更换试剂批号时仪器关键零部件更换时室内质控失效时质控每批样品检测时，建议使用迈瑞公司提供的配套质控品进行内部质量控制。

谷丙转氨酶测定程序(赖氏法)一、原理与意义：谷丙转氨酶(ALT/GPT)在37℃及PH7.4条件下，作用于丙氨酸及ɑ-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。

反应30 min后(固定时间)加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即中止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。

苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505 nm测定吸光值并计算酶活力。

根据ALT活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度。

二、试剂及其配制：1.谷丙转氨酶基质液：4 ℃冰箱保存。

2.2,4-二硝基苯肼(DNPH)液：室温避光保存。

3. 4 mol/LNaOH：用时加蒸馏水稀释至0.4 mol/L，室温保存。

4. 2 mol/ml丙酮酸钠标准液，室温保存。

5.0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4 ℃冰箱保存。

三、仪器设备：离心机、7 ml离心管、移液器、分光光度计、玻璃比色杯、水浴锅、玻璃棒、冰箱、烧杯、量筒等。

四、操作步骤：1、血清制备：采集全血，室温放置1～2 h，3000 r×15 min离心取上清，待测。

2、血清ALT的测定：表1 血清ALT的测定加样顺序(ml)测定管对照管血清0.1基质液（37 ℃已预热5 min）0.5 0.5混匀后，37 ℃水浴30 min2，4－二硝基苯肼液0.5 0.5血清0.1混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5混匀,室温放置5 min，505 nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度的差值，查标准曲线，求得相应ALT/GPT活力单位。

五、结果计算与评价表2 标准曲线加样顺序0 1 2 3 4 50.1mol/L磷酸盐缓冲液(ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.102µmol/ml丙酮酸钠标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25谷丙转氨酶基质液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.252，4－二硝基苯肼液(ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5ALT标准曲线图六、注意事项：1.酶活力超过150单位时，用盐水稀释血清后重测。

授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。

生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。

根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。

试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。

2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。

3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。

4．0.4mol/L NaOH溶液。

5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。

此液应新鲜配制，不得久放。

操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。

丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（丙氨酸底物法）
2、性能指标
2.1外观和性状
外观和性状应符合表2要求。

表2 试剂盒内各组分的外观性状
2.2试剂空白
2.2.1试剂空白吸光度
试剂以蒸馏水为空白时，波长 340nm，光径 1.0 cm，温度 37℃，吸光度≥
1.0。

2.2.2试剂空白吸光度变化率
试剂以蒸馏水为空白时，波长 340nm，光径 1.0 cm，温度 37℃，吸光度变化率≤0.004。

2.3分析灵敏度
试剂盒测试130 U/L被测物时，吸光度变化率≥0.015。

2.4线性范围
2.4.1试剂盒在10 ~1000 U/L区间（范围）内，其回归系数r≥0.990。

2.4.2相对偏差或绝对偏差应符合表 3 要求。

表3 相对偏差或绝对偏差
2.5精密度
2.5.1试剂盒批内精密度 CV 值应≤4.0%。

2.5.2试剂盒批间相对极差（R）应≤5.0%。

2.6准确度
1
相对偏差（Bias%）应在参考物质靶值±10%以内。

2.7液体装量
试剂盒不同规格的净含量应不少于其标示量。

2。

第 1 页，共3 页谷丙转氨酶（GPT/ALT ）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1555规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×2支4℃保存试剂二液体3.5 mL×1瓶4℃保存试剂三液体30 mL×1瓶4℃保存标准液液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂一：提供1个8 mL 棕瓶；临用前取1支试剂一倒入空瓶中，用2 mL 蒸馏水溶解，再用溶液将试剂一残留试剂润洗下来；2、标准液：20 μmol /mL 丙酮酸钠。

产品说明：谷丙转氨酶又叫丙氨酸氨基转移酶（EC 2.6.1.2），GPT （EC 2.6.1.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和酮酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要作用。

此外，哺乳动物肝细胞GPT 活性很高，当肝细胞坏死，GPT 释放到血液中，血清GPT 活性显著增高。

因此，GPT 被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。

GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm 读取吸光值并计算酶活力。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞或细菌的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL 提取液，超声波破碎细胞或细菌（功率20%，超声3s ，间隔10s ，重复30次）。

丙氨酸胺基转移酶测定SOP_ALT临床意义_检验科生化项目SOP丙氨酸胺基转移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）是一种广泛存在于人体肝脏、心脏、肌肉、肾脏等组织中的酶，也是临床常用的生化指标之一、ALT水平的测定对于判断肝脏功能异常、诊断肝病以及监测治疗效果等方面具有重要的临床意义。

ALT测定的方法多样，其中常用的是酶促动力学法（Enzymatic Method），根据它在临床实验室中所编制的检验科生化项目SOP （Standard operating procedure），以下是一个大致的SOP描述：一、仪器与试剂准备：1.准备分光光度计、比色皿、移液器、计时器等常规实验室设备。

3.试剂室内温度要保持在15-25℃，避免试剂的高温和阳光直射。

4.准备质量控制品，用于质控测定，确保测定结果的准确性和可靠性。

二、样本准备：1.首先从病人或者健康受试者采集适量的血样，采用无抗凝剂的干管采血，保证采样时的无菌操作。

2.快速分离血清并尽快进行测定，避免搅拌和离心操作。

3.如果无法立即测定，血清应储存于-20℃以下的低温环境中，确保样本的稳定性。

4.样本在测定前应恢复至室温，并充分混匀至均匀液体。

三、操作步骤：1. 准确地取1ml标准和样本血清分别加入两个比色皿中。

2.在两个比色皿中分别加入相等的ALT试剂盒中提供的试剂，即ALT底物和ALT酶。

3.避免氧化反应的干扰，比色皿中的液体应尽快使用，并带入分光光度计中。

4.以酶反应的速率来计算ALT活性，通常使用每分钟多少个单位酶反应的方法。

5.根据试剂盒提供的标准曲线，将两个比色皿中的吸光度值与ALT标准品的吸光度值进行比较，计算出ALT的活性。

四、结果解释与质控：1.结果的单位一般为单位/升（U/L），正常成年人的ALT水平通常在10-40U/L之间。

2.高于正常范围的ALT水平常常是肝脏疾病的指示，如肝炎、肝硬化、肝癌等。

3.结果的准确性和稳定性需要进行质控，定期进行质量控制品的测定，并记录在质量控制记录簿中。