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一、1、蓝白筛选的原理LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。
MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。
当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。
因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。
当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。
相反，不互补则产生白色菌落。
如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。
从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。
2、影响转化率的几个重要因素⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。
此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。
不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。
⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。
载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。
1.取目的基因DNA10ul，加入到100ul的感受态细胞中，轻轻混匀，并置于冰上放置30min。
2.将感受态细胞于42 ℃水浴中热休克90s后迅速置于冰上放置2min。
3.加入800ulLB液体培养基（-AMP），37 ℃，200r/min摇菌液60min。
4.将摇菌后的转化菌液3000rpm离心3min，吸取LB液体上清液700ul弃除，留200ul液体在离心管内，轻轻吹打沉淀，然后取每组连接反应转化原液取200μl+40ul X-gal溶液+4ulIPTG溶液混匀，用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
5.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
放于4℃数小时,使显色完全。
6.用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
重组DNA的化学转化与蓝白斑筛选实验目的1.掌握重组DNA的化学转化的实验原理及操作过程。
2.熟悉蓝白斑筛选的原理及鉴定重组转化子的方法。
实验原理1.化学转化转化是指将外源DNA导入细菌、真菌的过程，使外源DNA在宿主细胞内进行复制和表达。
将感受态细胞和外源DNA混合物冰浴后，经42℃短时间的热激处理，感受态细胞液晶结构的细胞膜表面产生裂隙，有利于感受态细胞吸收摄取DNA复合物。
因此，外源DNA通过吸附、转入、自稳进入细胞内，从而得以复制、表达。
2蓝白斑筛选蓝白斑筛选是筛选重组子的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。
在添加有X-gal、IPTG 和相应抗生素的培养基上，未含有重组质粒的菌落因为没有抗生素抗性，不能生长，而含有重组质粒的菌落是白色的，含有非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色为依据直接筛选重组子。
培养基中的IPTG可诱导载体Lac操纵子DNA区段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，该片段可与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α互补）。
实现α互补的细菌涂布在含有X-gal生色底物的培养基上，可形成蓝色菌落，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可破坏α互补作用，将产生白色菌落。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、移液器、移液器吸头、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机、涂布棒、连接体系（重组DNA pUC19-3055）等。
实验试剂（1）大肠杆菌感受态细胞。
（2）培养基：LB，LA。
（3）溶液：20mg/ml X-gal溶液（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），50mg/ml IPTG溶液（异丙基硫代半乳糖苷），100mg/ml Amp 溶液（氨苄青霉素）。
实验操作（1）从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置于冰上融化。
（2）将10μl的连接体系加入已融化的感受态细胞中，混匀后冰浴20min。
（3）将上述混合物置于42℃水浴锅中热激90s，随后立即冰浴3～5min。
蓝白斑筛选的原理及应用1. 前言蓝白斑筛选（Blue-white screening）是一种常用的分子生物学技术，用于检测DNA重组是否成功。
通过该技术，可以筛选出含有重组DNA的菌落，从而实现对目标基因的定位和表达。
2. 原理蓝白斑筛选的原理基于β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的活性差异。
在该筛选系统中，包含有DNA重组产物的细菌表型为蓝色，未重组的细菌表型为白色。
具体的实验步骤如下：1.在含有相应选择性抗生素的培养基上培养细菌。
2.通过转化技术将重组的质粒DNA导入细菌宿主中。
3.将转化后的细菌涂布在含有X-半乳糖苷（X-Gal）的琼脂糖平板上。
4.在琼脂糖平板上，转化成功的细菌会表现为蓝色的菌落，未转化的细菌则为白色。
3. 应用蓝白斑筛选广泛应用于基因克隆、基因工程、蛋白质表达等研究领域。
3.1 基因克隆在基因克隆中，蓝白斑筛选常用于检测重组质粒的构建是否成功。
通过筛选出蓝色的菌落，可以快速确定重组质粒中是否含有目标基因。
3.2 基因工程在基因工程中，蓝白斑筛选被用于定位和筛选带有特定序列的质粒。
通过构建含有目标基因的质粒，将其导入细菌中，可以筛选出含有目标基因的蓝色菌落，从而实现对基因的定位和表达。
3.3 蛋白质表达蓝白斑筛选还可以用于蛋白质表达的研究。
通过将目标蛋白基因插入表达载体中，并导入细菌中进行表达，可以通过蓝白斑筛选系统筛选出表达目标蛋白的菌落。
4. 优势和局限性4.1 优势•简单易行：蓝白斑筛选是一种简单易行的筛选方法，无需复杂的仪器设备，只需要琼脂糖平板和相应的培养基。
•高效性：通过蓝白斑筛选系统，可以快速筛选出重组细菌，提高工作效率。
•直观可视化：转化成功的细菌会在琼脂糖平板上形成蓝色的菌落，使得检测结果可以直观地通过肉眼观察。
4.2 局限性•假阳性筛选：由于β-半乳糖苷酶活性的变异性，部分非重组菌落也可能呈现蓝色。
因此，在分析筛选结果时需采取其他方法进行验证。
蓝白斑筛选的原理蓝白斑筛选（Blue-White Screening）是一种常用的分子生物学技术，通常用于筛选含有外源DNA插入物的重组质粒。
该技术利用大肠杆菌菌株对β-半乳糖苷酶（LacZ）基因的表达特性，通过对含有外源DNA插入物的质粒进行筛选，从而实现对感兴趣基因的快速鉴定和分离。
本文将对蓝白斑筛选的原理进行详细介绍。
蓝白斑筛选的原理主要基于大肠杆菌菌株对β-半乳糖苷酶（LacZ）基因的表达特性。
在正常情况下，大肠杆菌可以利用乳糖作为碳源，并通过LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。
而在蓝白斑筛选中，常用的质粒载体中含有LacZ基因的启动子和终止子，当外源DNA插入到LacZ基因的编码区域时，会导致LacZ基因的破坏或失活，从而影响对乳糖的水解能力。
在含有外源DNA插入物的质粒被转化到大肠杆菌菌株中后，通过将细菌涂抹在含有X-半乳糖苷和异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的平板上进行培养。
在这种培养条件下，正常菌落会呈现蓝色，而含有外源DNA插入物的菌落则会呈现白色。
这是因为IPTG可以诱导LacZ基因的表达，而X-半乳糖苷可以作为底物被β-半乳糖苷酶水解，产生蓝色产物。
而当LacZ基因失活时，无法水解X-半乳糖苷，菌落呈现白色。
通过观察菌落的颜色，可以快速筛选出含有外源DNA插入物的重组质粒。
蓝白斑筛选技术具有操作简单、快速、高效的特点，广泛应用于重组质粒的筛选和鉴定。
通过该技术，科研人员可以快速鉴定感兴趣基因的载体，并进行后续的分子生物学实验。
同时，蓝白斑筛选也为基因工程领域的研究提供了重要的技术支持，推动了基因克隆和表达等领域的发展。
总之，蓝白斑筛选技术是一种重要的分子生物学技术，基于大肠杆菌对LacZ基因的表达特性，通过对含有外源DNA插入物的质粒进行筛选，实现对感兴趣基因的快速鉴定和分离。
该技术操作简单、快速、高效，广泛应用于基因工程领域，为相关研究提供了重要的技术支持。
