多肽序列分析题答案

基于质谱的蛋白质鉴定，第4节：基于MALDI-MS-PSD的多肽序列分析尽管MALDI原则上是一种软电离技术，几乎只产生完整的生物分子离子，但MALDI在电离过程中会形成相当程度的亚稳态离子。

对于肽和蛋白质离子，这种亚稳定的离子行为不仅会引起中性小分子（如水和氨）的损失，还会引起多种肽键断裂。

MALDI-MS中有两种不同类型的碎片反应：（i）在激光撞击后几百ns内，质谱仪的离子源附件的离子的“迅速碎片” （prompt fragmentation）和（ii）PSD则需要较长一些的时间（μs），在将来源于MALDI的离子从离子源提取到RETOF质谱仪的第一个无电场区域的过程。

一般认为，分析物离子在萃取过程中的碰撞激活，以及在电离过程后能量过剩的离子的单分子衰变，都被认为是造成PSD现象的原因。

由于PSD发生在无电场区域，碎片离子的速度与其完整的母离子保持相同的速度，因此在线性MALDI-MS光谱中不能被观察到。

可以通过用一个静电离子镜或“场电子场”代替无场区末端的检测器，这会颠倒入射离子的飞行路径，碎片离子就可以从其完整的母离子中分离出来。

由于它们的动能较小，它们不像完整离子那样深入反射层，因此会更早地从该场中弹出，并且在MALDI-RETOF-MS光谱中的表观质量会低于其前体离子。

由于大多数反射电子场在给定的电压设置下仅具有有限的动态分离范围，因此需要将其逐步降低到较低的电压，以便分离和聚焦整个目标碎片质量范围（通常可以获得10-15个片段）。

一旦反射电子场通过人工合成的已知肽段进行了校准，即可将片段光谱胶合在一起以形成PSD光谱，这时所有片段离子的质量都可以确定。

也可以使用弯曲场反射器，将场几何（field geometry）同时应有于分离和聚焦产生的所有碎片离子，从而避免使用单级或双级反射器的耗时的电压渐进过程。

通过研究肽离子的MALDI-PSD片段，可以推测PSD是酰胺键断裂的主要结果，非常类似于低能碰撞活化解离（CAD）诱导的肽的片段化行为。

多肽合成思考/练习题1.目前多肽的常见定义？多肽的结构单元？α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，其分子量不超过 10,000 ，并且不存在三级以上结构。

结构单元是氨基酸2.多肽的类别及其分类原则，多肽固相合成法、液相合成法的对应英文？Fmoc Chemistry 固相合成单循环包括几个步骤？对应名称？大小 9肽以下寡肽15肽以下小肽15-50肽中肽多于50肽大肽结构同聚肽: 线性肽, 环肽杂聚肽: 色素肽,糖肽,脂肽,缩酯肽来源抗菌肽,激素肽,毒肽液相合成法 Liquid phase peptide synthesis,LPPS固相合成法 Solid phase peptide synthesis,SPPSFmoc Chemistry 固相合成单循环：缩合，洗涤，去保护，中和及洗涤，下一轮缩合5.多肽合成中常见副产物有哪些？多肽偶联反应的最高追求？多肽裂解中常常加入俘获剂（Scavengers）。

Scavengers的主要作用是啥？常见俘获剂有哪些？各自特点？副产物：形成天冬酰亚胺，或发生差向异构化作用8.多肽合成中如何检查偶联反应的完成程度、树脂替代度和Fmoc脱除程度？9.解决困难肽序合成的常见方法？各自特点？10.请比较经Boc-、Fmoc-、Z-三种保护基保护的氨基酸的特点。

11.多肽固相合成中产生二酮哌嗪(diketopiperazine，DKP)是一常见副反应。

请给出产生二酮哌嗪的主要原因以及减少DKP形成的常见方法。

减少DKP形成的常见方法:使用与叔丁基等效的大基团来以位阻阻止DKP的形成。

12. 请给出多肽消旋的主要原因以及目前公认的2种机理P157。

多肽合成过程中，部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋，特别容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，当然这些消旋化还和溶剂，温度以及合成中的有机碱等因素有关。

对于这些氨基酸，可以通过采用高效缩合试剂，减少反应时间，可以减少消旋的比例13. 给出常见的巯基保护剂P131，请给出二硫键的常见形成方法。

高考生物《蛋白质的计算分析》真题练习含答案1．血红蛋白分子由2条α链和2条β链组成，其中α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成，血红蛋白分子中肽键的数目是()A．141个B．146个C．570个D．574个答案：C解析：血红蛋白含有4条肽链，共2×141＋2×146＝574个氨基酸，因此氨基酸脱水缩合反应形成的肽键数＝574－4＝570个。

2．经分析某条多肽链中有O原子p个，N原子q个，它彻底水解后，只得到下列四种氨基酸。

分析推算可知，1分子该多肽水解得到的赖氨酸个数为()A．p－q B．q－pC．p－q＋1 D．q－p＋1答案：D解析：根据图示分析可知：半胱氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸中都只有一个氨基和一个羧基，而赖氨酸中含有两个氨基和一个羧基，所以它们在核糖体上合成蛋白质时，通过脱水缩合形成的一条多肽链中，含多个游离的氨基和一个游离的羧基，因此，按氧原子数目计算，氧原子数＝氨基酸数＋肽链条数＋R基上氧原子数，分析这四种氨基酸的R基可知，四种氨基酸的R基上均无氧原子，所以氨基酸数为p－1；多肽中N原子数＝氨基酸数＋R基上的N 原子总数，四种氨基酸中只有赖氨酸的R基上有一个N原子，所以赖氨酸数为q－(p－1)＝q－p＋1。

3．绿色荧光蛋白简称GFP，最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的结构蛋白。

其相关数据如图所示，下列有关叙述错误的是()A.该蛋白质含有2条肽链B．该荧光蛋白含有的氮原子数是126C．该蛋白质共有肽键124个D．合成该蛋白质时，相对分子质量减少了2 232答案：B解析：游离的羧基数＝肽链数＋R基上的羧基数，17＝肽链数＋15，肽链数是2，该蛋白质含有2条肽链，A正确；氮原子数＝氨基酸数目＋游离的氨基总数－肽链数，氮原子数＝126＋17－2＝141个，B错误；肽键数＝氨基酸总数－肽链数＝126－2＝124，该蛋白质共有肽键124个，C正确；合成该蛋白质时，脱水数＝肽键数＝124，相对分子质量减少了18×124＝2 232，D正确。

生物化学（第三版）课后习题详细解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。

蛋白质中的氨基酸都是L型的。

但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。

参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。

此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。

除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。

氨基酸是两性电解质。

当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。

在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。

某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI 表示。

所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。

α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（ Edman反应）。

胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。

半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。

这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。

除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。

比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。

参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。

核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。

氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。

常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。

习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

百泰派克生物科技
多肽氨基酸序列分析
多肽的氨基酸序列分析就是对组成多肽的氨基酸种类、数量以及排列次序进行鉴定，也称为多肽测序，属于多肽一级结构鉴定的内容。

目前较常用的多肽氨基酸序列分析方法包括经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法以及新兴的质
谱法等。

Edman降解法主要是对多肽的N末端氨基酸序列进行分析，但是其对N末端封闭的
肽链无能为力。

此外，Edman降解法测序速度较慢、样品用量较大、样品纯度要求
很高，而且对发生修饰的氨基酸残基识别的准确性不高。

C末端测序法在寻找理想
的PITC化学探针方面仍面临着很大的困难。

在这种背景下，高分辨率（达fmol 级）、高准确性以及操作简便的质谱测序技术则备受青睐，质谱分析技术的灵敏度
及准确性与待测物的分子质量成负相关，分子量增大时检测结果的准确性明显降低，多肽的分子量相比蛋白质小得多，因此采用质谱进行多肽氨基酸序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC
纳升色谱，提供高效精准的蛋白/多肽氨基酸序列分析服务技术包裹，可对各种蛋
白/多肽样品的一级结构进行解析，包括多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
以及多肽链内或链间二硫键的位置和数目等，欢迎免费咨询。

1.举例说明化学与生物化学之间的关系。

提示:生物化学是应用化学的理论和方法来研究生命现象，在分子水平上解释和阐明生命现象化学本质的一门学科.化学和生物化学关系密切，相互渗透、相互促进和相互融合。

一方面，生物化学的发展依赖于化学理论和技术的进步，另一方面，生物化学的发展又推动着化学学科的不断进步和创新。

举例:略。

2.试解释生物大分子和小分子化合物之间的相同和不同之处。

提示:生物大分子一般由结构比较简单的小分子，即结构单元分子组合而成，通常具有特定的空间结构。

常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖类。

生物大分子与小分子化合物相同之处在丁:1)共价键是维系它们结构的最主要的键;2)有一定的立休形象和空间大小;3)化学和|物理性质主要决定于分子中存在的官能团。

生物大分子与小分子化合物不同之处在于:(1)生物大分子的分子量要比小分子化合物大得多，分子的粒径大小差异很大;(2)生物大分子的空间结构婴复杂得多，维系空间结构的力主要是各种非共价作用力;(3)生物大分子特征的空间结构使其具有小分子化合物所不具有的专性识别和结合位点，这些位点通过与相应的配体特异性结合，能形成超分子，这种特性是许多重要生理现象的分子基础。

3.生物大分子的手性特征有何意义?提示:生物大分子都是手性分子，这种结构特点在生物大分子的分子识别及其特殊的生理功能方面意义重大。

主要表现在:(1)分子识别是产生生理现象的重要基础，特异性识别对于产生特定生物效应出关重要;(2)生物大分了通过特征的三维手性空间环境能特异性识别前手性的小分子配体，产生专一性的相互作用。

4.指出取代物的构型：6.举例说明分子识别的概念及其意义。

提示::分子识别是指分子间发生特异性结合的相互作用，如tRNA分子与氨酰tRNA合成醉的相互作用，抗体与抗原之间的相互作用等。

分子识别是生命体产生各种生理现象的化学本质，是保证生命活动有序地进行的分子基础。

7.什么是超分子?说明拆分超分子的方法和原理。

18 多肽 蛋白质和核酸习题参考答案1. 写出下列化合物的构造式：(1) 丙氨酰甘氨酸 (2) 谷·半胱·甘肽答案（1） （2）2. 某三肽完全水解后，得到甘氨酸和丙氨酸。

若将此三肽与亚硝酸作用后再水解，则得乳酸、丙氨酸及甘氨酸。

写出此三肽的可能简写名称。

答案：丙-甘-丙 或 丙-丙-甘。

3. 有一个寡肽甲，经测定知其氨基酸组成为:Ala, 2Gly, Lys, 3Phe, Ser, Val 。

端基分析得知其C 端是苯丙氨酸，N 端是甘氨酸。

当用胰凝乳蛋白酶催化水解时得到了两个肽—甲1和甲2。

甲1完全水解得到2个Gly, 1个Phe 和1个Val ；甲2得Ala, Lys, 2个Phe, Ser 。

请写出寡肽甲可能的简写名称。

(此题删去)答案：可能的名称之一为 甘-苯丙-缬-甘-苯丙-丝-赖-丙-苯丙。

4. 什么是蛋白质的一级结构？蛋白质的一级结构与空间结构有何关系？答案：蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序。

蛋白质的一级结构决定其空间结构5. DNA 分子二级结构有哪些特点？答案： DNA 的结构特点有：两条反相平行的多核苷酸链围绕着同一中心轴互绕；碱基位于结构的内侧，而亲水的糖磷酸主链则位于螺旋的外侧，通过磷酸二酯键相连，形成核酸的骨架；碱基平面与轴垂直，糖环平面与轴平行。

两条链皆为右手螺旋；双螺旋的直径是2nm ，碱基堆积距离是0.34nm ，两核酸之间的夹角为36°，每对螺旋由10对碱基组成；碱基按A=T ，G≡C 配对互补，彼此以氢键相互连系。

维持DNA 结构稳定的力量主要是碱基堆积力；双螺旋结构表面有着两条螺形凹沟，一大一小。

6. 解释下列各种条件可使蛋白质变性的原因：(1) Pb 2+和Ag + (2) 尿素 (3) 紫外线(4) 强酸、强碱 (5) 加热答案：（1）重金属离子可以和蛋白质中游离的—COO - 形成不溶性盐。

（2）尿素是很好的氢键受体，使蛋白质原有的氢键被破坏。

二级质谱多肽测序多肽（Peptides）是一类具有广泛生物功能的由两个或多个氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子。

二级质谱（Tandem mass spectrometry，简称MS/MS）多肽测序即通过串联质谱技术对蛋白质或多肽的氨基酸组成和排列顺序进行鉴定的技术。

在一级质谱中多肽片段被离子化并根据质荷比进行分析，生成一级质谱——多肽片段的质荷比及相对丰度。

碎裂后产生的多肽片段再次经过质荷比分析，生成二级质谱——碎片离子的质荷比和相对丰度信息。

常用的二级质谱方法主要包括ESI-MS/MS （电喷雾电离串联质谱）、MALDI-MS/MS（基质辅助激光解吸电离串联质谱）、LC-MS/MS（液相色谱串联质谱）。

百泰派克生物科技BTP二级质谱多肽测序一般流程1.蛋白提取。

2.酶解：用特定蛋白酶将蛋白质切割成多肽片段。

3.分离与纯化：使用液相色谱对酶解产生的多肽进行分离纯化。

4.离子化：将多肽样品转变为气相离子。

5.一级质谱分析：分析气相离子质量，获得多肽质荷比m/z信息。

6.离子碎裂：碎裂特定多肽离子，产生碎片离子。

7.二级质谱分析：分析碎片离子质量，获得碎片离子质荷比m/z信息。

8.数据处理与分析：对比二级质谱数据与已知蛋白质数据库推断多肽片段的氨基酸序列。

二级质谱多肽测序技术优势1.高灵敏度。

二级多肽质谱测序能够检测到低至皮克摩尔（pmol）甚至飞摩尔（fmol）水平的多肽。

2.高精度与高分辨率。

二级质谱技术通过对多肽碎片的质荷比进行精确测量，可以精确识别多肽片段和质量相近的离子，提供关于多肽序列的准确信息。

3.高通量。

二级质谱技术可以在短时间内分析大量样品。

结合液相色谱等分离技术，二级质谱可以快速鉴定复杂生物样品中的成千上万种蛋白质。

4.高序列覆盖率。

较高的序列覆盖率可以提高蛋白质和多肽鉴定的准确性。

中/英文项目报告。

在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1.实验步骤（中英文）。

多肽药物质谱法全序列分析
多肽药物是一种生物大分子药物，由数个到几十个氨基酸通过肽键连接而成，具有广泛的生物活性，可以通过精确地和机体中的特定受体结合来发挥药效。

这种特异性的结合方式使得多肽药物在治疗各种疾病（如癌症、糖尿病和自身免疫病）时，具有良好的疗效和较低的副作用。

然而，多肽药物的质量控制是一大挑战。

由于它们的结构复杂、容易降解，并且常常含有一种或多种的修饰形式，因此，对多肽药物进行全序列分析以确保药物的质量和安全性是非常必要的。

质谱法全序列分析可以用于分析多肽药物的整个氨基酸序列以及任何可能的修饰。

这种方法通过将多肽分解为更小的片段，然后分析这些片段的质量，以确定多肽的氨基酸序列。

质谱法的敏感性高，分辨率好，可以检测到微量的样品，并能在复杂样品中精确地识别目标物质。

此外，质谱法可以定性和定量分析，对于研究药物的构效关系、药物代谢和药物的稳定性等方面都有非常重要的应用。

特别是在多肽药物的开发和生产过程中，质谱法全序列分析被广泛用于药物的质量控制，以确保药物的安全性和疗效。

生物制品表征质谱法全序列分析示意图。

百泰派克生物科技（BTP），采用ISO9001认证质量控制体系管理实验室，获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务。

我们利用现有的高分辨率质谱技术平台，开发出以质谱为基础的多肽药物质谱法全序列分析技术，实现对所测定靶蛋白多肽序列100%的覆盖。

此分析可以用于确认多肽是否得到完整表达，检测多肽表达过程是否发生断裂。

百泰派克生物科技多肽药物表征内容。