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番茄SlWRKY40基因VIGS表达载体构建及其沉默效率检验刘波【摘要】WRKY蛋白伴随植物适应环境的过程进化而来,具有重要调节作用.番茄中存在大量WRKY基因,其功能研究却严重滞后.本实验体外扩增了番茄SlWRKY40基因,构建了pTRV-SlWRKY40病毒诱导的基因沉默表达栽体,实时定量PCR法检测了SlWRKY40在番茄中的沉默效率.结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60％以上,单株最高可达80％左右.本实验中的工作为我们今后研究SlWRKY40的生物学功能做了必要的前期准备,同时为研究番茄WRKY家族其他成员的功能提供了技术支撑.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2018(064)002【总页数】5页(P23-27)【关键词】番茄;SlWRKY40;转录因子;VIGS;沉默效率【作者】刘波【作者单位】渭南职业技术学院,陕西渭南714026【正文语种】中文病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术根据植物抵抗病毒的原理发展而来，因为具有短时间获得实验结果、不需要遗传转化、能够研究在转基因植株中致死的基因的功能等优点，已经被普遍应用于植物基因功能研究[1～3〗。
WRKY 蛋白由于独特的结构特征构成一个植物转录因子大家族[4～7]，并以特有的功能方式调控植物生理过程[4, 8～17]。
研究WRKY基因的功能对我们认识植物进而更好地改造和应用植物资源具有重要的现实意义。
番茄进化过程中形成了至少八十个WRKY基因[18]，急需对其功能展开研究。
由于其体系成熟和高效性，许多科研团队都采用由烟草脆裂病毒(TRV)改造而成的VIGS载体研究植物的基因功能。
我们从番茄中克隆了一个具有WRKY结构域的基因，将其命名为SlWRKY40。
为了后期探究其生物学功能，我们构建了SlWRKY40基于TRV的VIGS沉默表达载体——pTRV-SlWRKY40，同时检验了其沉默效率。
结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60%以上，单株最高可达80%左右。
vigs原理VIGS原理。
VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种基因沉默技术，通过利用病毒来诱导植物基因的沉默，从而研究基因功能和调控机制。
VIGS技术是一种快速、高效的基因沉默方法，被广泛应用于植物分子生物学研究中。
本文将介绍VIGS的原理及其在植物科学研究中的应用。
VIGS的原理主要是利用病毒载体来携带目标基因片段，并通过病毒的侵染和复制过程，将目标基因片段转录成siRNA（小干扰RNA），siRNA能够诱导RNA干扰（RNAi）途径，从而导致目标基因的沉默。
VIGS技术的关键在于选择合适的病毒载体和目标基因片段，以及优化转染条件和病毒复制过程，从而实现对目标基因的特异性沉默。
VIGS技术在植物科学研究中有着广泛的应用。
首先，VIGS可以用来研究基因功能。
通过沉默目标基因，可以观察到植物表型的变化，从而推断目标基因在生物学过程中的作用。
其次，VIGS还可以用来研究基因调控网络。
通过沉默一个基因，可以观察到其他相关基因的表达变化，从而揭示基因之间的相互作用关系。
此外，VIGS还可以用来筛选抗病基因。
通过沉默潜在的抗病基因，可以评估其对病原体的抗性作用，为植物抗病育种提供理论基础。
总之，VIGS技术是一种重要的基因沉默方法，具有快速、高效、特异性的优点，被广泛应用于植物科学研究中。
随着分子生物学技术的不断发展，VIGS技术在植物基因功能和调控研究中将发挥越来越重要的作用。
希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解VIGS的原理及其在植物科学研究中的应用，为相关领域的研究工作提供参考和借鉴。
摘要：植物抗病性是研究植物与病原体之间相互关系中寄主植物抵抗病原体侵染的性能，这是植物的一种属性。
对于植物的抗病性,人们早就从遗传学角度进行了研究。
40 年代通过遗传分析，提出了基因对基因学说，认为抗性是植物品种所具有抗性基因和与之相应的病原体的非致病性基因结合时才得以表现，从遗传上初步说明了病原体和寄主的相互关系。
60 年代发现寄主对病原体侵染的过敏反应，认为这是寄主对病原体侵染防卫反应。
70 年代开始运用分子生物学技术分析病原体的无毒基因和致病基因，开始确定寄生的防卫基因。
80 年代研究得到寄主系统抗病反应与水杨酸相关。
90年代开始克隆寄主的抗病基因。
从病毒诱导基因沉默的遗传学和分子生物学角度来探讨植物抗病的可能机制，基因沉默是近十年来在转基因植物中发现的一种后生遗传现象。
基因沉默大体可以分为两类：位置效应引起的基因沉默和同源依赖的基因沉默。
其中，同源依赖的基因沉默又可以分为转录水平的基因默和转录后水平的基因沉默。
基因沉默的发现使得人们对植物和病毒的相互关系有了一个新的认识。
基因沉默研究中所发现的转录后基因沉默现象是植物抵御病毒入侵、保持自身基因组完整性的一种防御机制，是植物与病毒共进化的结果。
对于沉默产生的机理，尤其是转录后基因沉默，已经提出不少模型，有阈值模型、异常RNA模型、生化开关模型、反义RNA模型等，但是都未能较全面地解释基因沉默中出现的各种实验现象。
该文现就实验所取得的相关结果、转录后基因沉默机制和植物对病毒防御机制的相互关系，以及其研究进展进行综述。
植物病毒是农作物生产上的主要病害之一，据统计，全球共有几百种植物病毒。
植物病毒有时会对粮食产量和人类数量产生灾难性的影响。
仅以马铃薯为例，因马铃薯X 病毒(PVX) 造成的损失可达10 % ，马铃薯Y 病毒( PVY) 所造成的损失可高达80 %。
对病毒病的研究始于20 世纪初，1928 年Wingard[28]首次发现了“恢复”( recovery) 现象，即植物受到病毒侵染发病后，经过一定时间植株可以从病毒侵染症状中“恢复”过来，新长出的叶片不再感染病毒，具有了一定的抗性。
园艺学报2008,35(2):227-232A cta H o rti culturae S i n i ca病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析杨迎伍1,李正国1*,M ondher Bouzayen2(1重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市功能基因及调控技术重点实验室,重庆400044;2UM R990 INRA/INP-EN S A果实基因组及生物技术实验室,法国图卢兹31326)摘要:病毒诱导的基因沉默(V IGS)是植物基因功能研究的新技术。
以组成型表达gus A基因的转基因番茄为材料,通过V I GS技术沉默gus A基因,对V I G S在番茄中的组织特异性进行了初步分析。
结果表明,V I G S技术能有效地诱导gus A基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明V I GS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。
关键词:番茄;病毒诱导的基因沉默;基因功能;组织特异性;烟草脆裂病毒中图分类号:S64112文献标识码:A文章编号:0513-353X(2008)02-0227-06T issue Specificity Analysis of V irus-i nduced G ene Sil enci ng i n To matoYANG Y ing-wu1,LI Zheng-guo1*,and M ondher Bouzayen2(1K e y Laboratory of F unctional Gene and R egulation T echno logies of Chongq i ng,Genetic E ngineer i ng R esearch C enter,B i o-E ngi-neer i ng Co llege,Chongqing Universit y,Chongqing400044,China;2U M R990INRA/I NP-EN S A T oulouse G enom ique et B i o tech-nolog ie des Fruits,A v de l p A grobiop ole,BP32607,31326Castanet-T olosan Cedex,France)A bstract:V irus-i n duced gene silenc i n g(V I GS)is a recently developed techn i q ue for gene functi o n study i n p lants.In t h is study,the gus A transgenic to m ato plan twh ich constituti v ely expressed gus A gene w as used asm ateria.l The gus A gene w as sil e nced by V I G S for the preli m i n ary tissue spec ific ity analysis ofV I GS in to m ato.The resu lts show ed that gus A cou l d be silenced in leaves,fl o w ers,fruits,branches,ste m s and the po ints bet w een branch and ste m o f to m ato by v ir us-i n duced gene silenci n g.So V I GS,as a po w erfu l too l for the study of gene function,cou l d i n duce target gene syste m atic silencing i n to m ato.K ey words:to m ato;vir us-induced gene silencing;gene function;tissue specificity;Tobacco rattle vir us病毒诱导的基因沉默(v irus-i n duced gene silencing,V I GS)是近年来发现的一种转录后基因沉默(pos-t transcri p tional gene silencing,PTGS)现象,可引起内源mRNA序列特异性降解(R atc liff et a.l, 1997)。
应用于茄子的病毒诱导的基因沉默体系的建立与优化刘军;杨艳;周晓慧;姜悬云;鲍生有;庄勇【摘要】本研究以八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因作为指示基因,探讨不同接种方式、培养环境、菌液数量浓度和接种时间对烟草脆裂病毒(TRV)诱导茄子植物内源PDS mRNA沉默效率的影响,进而测试该沉默体系在不同基因型茄子上的沉默效率.结果表明,在昼夜温度25℃/20℃,16 h光周期条件下,-25 kPa压强下真空抽气2 min渗透侵染露白后2～3 d的种子能够获得最佳沉默效率;与传统注射压迫法相比真空渗透萌芽种子能够更快、更明显出现沉默表型,缩短试验周期,且该方法在不同基因型茄子中都获得较高沉默效率,说明基于真空侵染萌芽种子法的VIGS体系可应用于茄子基因功能研究.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】7页(P880-886)【关键词】茄子;VIGS;真空侵染;萌芽期种子【作者】刘军;杨艳;周晓慧;姜悬云;鲍生有;庄勇【作者单位】江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014;江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京 210014【正文语种】中文【中图分类】S641.1病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing，VIGS)是通过一段携带靶基因序列的重组病毒载体侵染植株，植株出现目标基因功能丧失或者表达水平降低等现象，进而分析基因功能的方法[1-2]。
河南农业科学ꎬ２０１８ꎬ４７(７):８￣１９ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｄｏｉ:１０.１５９３３/ｊ.ｃｎｋｉ.１００４￣３２６８.２０１８.０７.００２收稿日期:２０１８－０１－１０基金项目:国家自然科学基金资助项目(３１３６０１６７)ꎻ宁夏回族自治区自然科学基金资助项目(ＮＺ１５１０７)ꎻ宁夏农林科学院对外科技合作项目(ＤＷ－Ｘ－２０１８０１２)作者简介:曲㊀玲(１９７２－)ꎬ女ꎬ宁夏银川人ꎬ副研究员ꎬ硕士ꎬ主要从事枸杞抗病性分子机制和枸杞生物技术抗病育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｑｌｉｎ１９７２＠１２６.ｃｏｍ∗通讯作者:曹有龙(１９６３－)ꎬ男ꎬ宁夏中宁人ꎬ研究员ꎬ博士ꎬ主要从事枸杞生物技术育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｏｕｌｏｎｇｃｈｋ＠１６３.ｃｏｍ病毒诱导的基因沉默在茄科植物基因功能研究中的应用进展曲㊀玲ꎬ李彦龙ꎬ安㊀巍ꎬ焦恩宁ꎬ赵建华ꎬ刘兰英ꎬ秦㊀垦ꎬ曹有龙∗(宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所/国家枸杞工程技术研究中心ꎬ宁夏银川７５０００２)摘要:茄科植物中有许多重要的经济与药用植物ꎬ随着茄科植物基因组测序工作的陆续完成ꎬ急需对基因组中大量功能未知基因的生物学功能进行鉴定ꎮ病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)是近２０ａ发展起来的一种研究植物基因功能的高效反向遗传学技术ꎬ在总结ＶＩＧＳ作用原理㊁ＶＩＧＳ载体开发和改良研究现状的基础上ꎬ就近年来ＶＩＧＳ在茄科植物品质性状㊁生长发育㊁植物－病原真菌互作以及代谢产物生物合成和调控相关重要基因功能分析等方面的国内外研究进展进行了综述ꎬ并讨论了ＶＩＧＳ技术应用于茄科植物存在的问题和前景展望ꎮ关键词:茄科植物ꎻ病毒诱导的基因沉默ꎻ基因功能解析ꎻＶＩＧＳ载体ꎻ植物－病原真菌互作ꎻ代谢产物生物合成与调控中图分类号:Ｑ９４３.２ꎻＳ４３２㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００４－３２６８(２０１８)０７－０００８－１２ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＶｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇｆｏｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎＳｏｌａｎａｃｅａｅＳｐｅｃｉｅｓＱＵＬｉｎｇꎬＬＩＹａｎｌｏｎｇꎬＡＮＷｅｉꎬＪＩＡＯＥｎｎｉｎｇꎬＺＨＡＯＪｉａｎｈｕａꎬＬＩＵＬａｎｙｉｎｇꎬＱＩＮＫｅｎꎬＣＡＯＹｏｕｌｏｎｇ∗(ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＷｏｌｆｂｅｒｒｙꎬＮｉｎｇｘｉａＡｃａｄａｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＮａｔｉｏｎａｌＷｏｌｆｂｅｒｒｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５０００２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｅｒｅａｒｅｍａｎｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓｉｎＳｏｌａｎａｃｅａｅ.Ｗｉｔｈｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｓｏｌａｎａｃｅｏｕｓｐｌａｎｔｓꎬｉｔｉｓｕｒｇｅｎｔｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｕｎｋｎｏｗｎｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅ.Ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ)ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓａｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉ￣ｃｉｅｎｔｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔ２０ｙｅａｒｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｓ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｔｈｅａｄｖａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｍｉｎｉｎｇｉｎｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓꎬｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬｐｌａｎｔ￣ｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｏｌａｎａｃｅａｅｓｐｅｃｉｅｓｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄａｆｔｅｒｓｕｍｍａｒｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆＶＩＧＳａｎｄｔｈｅｓｔａｔｕｓｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓ.Ｆｉｎａｌ￣ｌｙꎬｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆＶＩＧＳｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＳｏｌａｎａｃｅａｅｓｐｅｃｉｅｓꎻＶｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ)ꎻＧｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｔｕｄｙꎻＶＩＧＳｖｅｃ￣ｔｏｒꎻＰｌａｎｔ￣ｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎻＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀茄科(Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ)植物约８０属３０００种ꎬ在全世界热带和温带地区广泛分布ꎬ中国有２４属１１５种[１]ꎮ茄科植物中有许多种类是世界性的经济作物ꎬ与人类生活密切相关ꎬ如番茄㊁烟草㊁辣椒㊁马铃薯等ꎬ还有一些具有药用价值ꎬ如枸杞㊁颠茄等ꎮ近５ａ来ꎬ随着完成基因组测序工作的茄科植物种类的㊀第７期曲㊀玲等:病毒诱导的基因沉默在茄科植物基因功能研究中的应用进展增加ꎬ迫切需要对基因组中大量序列已知但功能未知的预测基因的生物学功能进行验证和鉴定ꎮ病毒诱导的基因沉默(Ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)是利用ＲＮＡ介导的植物防御病毒免疫机制而发展起来的一项诠释植物基因功能的反向遗传学技术ꎬ其内在的分子基础是转录后基因沉默(Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＰＴＧＳ)ꎮ其相比于以往的基因功能鉴定方法ꎬ如化学诱导突变及辐射突变㊁Ｔ－ＤＮＡ插入突变㊁图位克隆等技术ꎬ具有不需要建立植物遗传转化体系㊁可沉默基因家族㊁操作简单且周期短㊁重复性高和沉默效率高等优点[２]ꎬ适合植物基因的高通量功能分析ꎬ其无需具备清楚的遗传背景ꎬ无需构建和筛选转基因株系ꎬ因此ꎬ近年来广泛地用于模式和非模式植物基因的功能分析领域ꎮ自１９９５年Ｋｕｍａｇａｉ等[３]基于烟草花叶病毒(ＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴＭＶ)构建了第一个ＶＩＧＳ载体(ＴＭＶ－ＰＤＳ)并侵染烟草产生光漂白现象以来ꎬＶＩＧＳ技术在茄科植物中的应用已有２０多年ꎬ在烟草㊁马铃薯㊁番茄㊁辣椒㊁矮牵牛和枸杞等中均得到成功运用ꎬ鉴定或验证了包括次生代谢产物合成和调控通路㊁生长发育㊁抗病虫与非生物胁迫响应调控网络中的多种基因的功能ꎬ笔者就近年来ＶＩＧＳ技术在茄科植物功能基因挖掘中的研究进展进行总结ꎬ旨在为相关研究提供借鉴ꎮ１㊀ＶＩＧＳ的作用原理和发展ｖａｎＫａｍｍｅｎ最早使用ＶＩＧＳ一词来描述植物防御病毒侵染后的恢复现象[４]ꎬ现在已被研发成为利用构建插入目的基因片段的重组病毒载体ꎬ沉默植物内源基因的技术[５]ꎬ其作用机制是一种由ＲＮＡ介导的植物防御机制(ＲＮＡ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｆｅｎｓｅꎬＲＭＤ)ꎬ与转录后基因沉默现象相关[６]ꎮ当病毒侵染植物体后ꎬ在植物体内或病毒自身依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬＲｄＲＰ)作用下[７]ꎬ合成积累双链ＲＮＡ(Ｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡꎬｄｓＲＮＡ)启动ＰＴＧＳꎬ这些ｄｓＲＮＡ被一种称为ＤＩＣＥＲ－ｌｉｋｅ的ＲＮａｓｅⅢ样的核酸内切酶切成２１~２４ｎｔ的小分子量干扰ＲＮＡ(ＳｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡꎬｓｉＲＮＡ)ꎬｓｉＲＮＡ被ＲＮＡ诱导沉默复合体(ＲＮＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘꎬＲＩＳＣꎬ由Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白㊁内切酶㊁解旋酶等组成)所识别解离成单链后ꎬ组合成为ＲＩＳＣ的主要成员ꎬ作为模板通过碱基互补配对形式指导复合体切割与ｓｉＲＮＡ同源的病毒ｍＲＮＡꎬ使该ｍＲＮＡ降解[８]ꎮ利用植物对病毒侵染的这种天然免疫防御机制ꎬ在农杆菌的Ｔｉ质粒双元载体中重组带有多克隆位点的病毒基因组ｃＤＮＡꎬ在此基础上ꎬ克隆植物待沉默内源基因片段ꎬ插入该载体的多克隆位点ꎬ构建得到基因沉默病毒载体ꎬ将其转化农杆菌ꎬ侵染寄主植物后ꎬ同样会激发ＲＮＡ介导的植物防御机制ꎬ特异性地抑制寄主植物细胞中与该外源插入基因片段一致或与之同源的内源靶基因转录本的表达积累[９]ꎬ从而导致植物内源目标基因功能缺失或表达水平受抑制ꎬ植物体呈现出与靶基因相关的生理生化途径发生改变的性状ꎬ通过观察突变表型或测定相关的生理生化指标变化可有效鉴定该内源目标基因的功能[１０]ꎮ另外ꎬ作为ＶＩＧＳ过程中的可移动的信号分子ꎬ序列特异性的ｓｉＲＮＡ还可在ＲｄＲＰ作用下进行扩增ꎬ形成新的次级ｓｉＲＮＡꎬ在韧皮部进行长距离传播ꎬ使远离侵染位点的植物组织发生系统性的基因沉默[１１]ꎮＭｅｒｍｉｇｋａ等[１２]推测２４ｎｔ的ｓｉＲ￣ＮＡ最有可能是长距离传输的信号分子ꎮ另外大量结果表明ꎬ２１ｎｔ的ｓｉＲＮＡ通过胞间连丝进行短距离传播[１３]ꎮ目前ＶＩＧＳ技术已经成为通过暂时沉默目的基因而验证和鉴定植物基因功能的一种强有力的技术工具ꎮ２㊀茄科植物中ＶＩＧＳ载体的开发和改良㊀㊀利用ＤＮＡ重组技术ꎬ源于多种植物病毒的ＶＩＧＳ沉默载体被开发和应用ꎬ这些载体许多在茄科植物上得到成功运用(表１)ꎮ表１㊀茄科植物基因功能研究中的ＶＩＧＳ载体接种的茄科植物属名种名病毒载体类型名称接种组织和方法参考文献枸杞属(Ｌｙｃｉｕｍ)宁夏枸杞(ＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍＬ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒(ＴＲＶ)种子苗:真空侵染法ꎻ叶片注射法ꎻ浇灌侵染法[１４]黑果枸杞(Ｌｙｃｉｕｍｒｕｔｈｅｎｉ￣ｃｕｍＭｕｒｒ.)种子芽:真空侵染法曼陀罗属(Ｄａｔｕｒａ)曼陀罗(Ｄ.ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍＬ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[１５]９河南农业科学第４７卷续表１㊀茄科植物基因功能研究中的ＶＩＧＳ载体接种的茄科植物属名种名病毒载体类型名称接种组织和方法参考文献碧冬茄属(ＰｅｔｕｎｉａＪｕｓｓ.)矮牵牛(ＰｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａＶｉｌｍ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒叶:农杆菌注射渗透法[１６￣１７]种子苗:根吸收法茄属(Ｓｏｌａｎｕｍ)刺天茄(ＳｏｌａｎｕｍｉｎｄｉｃｕｍＬ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒１５ｄ种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[５]龙葵(ＳｏｌａｎｕｍｎｉｇｒｕｍＬ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法接种本氏烟ꎬ然后提取汁液摩擦接种ꎻ农杆菌真空浸透法[１８￣１９]马铃薯野生种(Ｓｏｌａｎｕｍｏｋａｄａｅ和Ｓｏｌａｎｕｍｂｕｌｂｏｃａｓ￣ｔａｎｕｍ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒１.５~２周的种子苗的叶:农杆菌喷雾接种法ꎻ农杆菌注射渗透法ꎻ农杆菌注射渗透法接种本氏烟ꎬ然后提取汁液摩擦接种[１８]马铃薯野生种(Ｓｏｌａｎｕｍｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ)ＲＮＡ病毒马铃薯Ｘ病毒(ＰＶＸ)２周的苗的叶:农杆菌牙签刺伤法[２０]马铃薯栽培种(Ｓｏｌａｎｕｍｔｕ￣ｂｅｒｏｓｕｍ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ农杆菌注射渗透法接种本氏烟ꎬ然后提取汁液摩擦接种种子苗:根吸收法[１７￣１８]马铃薯Ｘ病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ农杆菌牙签刺伤法[２０￣２１]茄子(Ｓｏｌａｎｕｍｍｅｌｏｎｇｅｎａ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ高压喷枪接种种子苗:根吸收法[１７ꎬ２２￣２４]假酸浆属(ＮｉｃａｎｄｒａＡｄａｎｓ.)假酸浆(Ｎｉｃａｎｄｒａｐｈｙｓ￣ａｌｏｄｅｓ)ＤＮＡ病毒瓦斯蒂克辣椒黄脉病毒(ＰＨＹＶＶ)种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]辣椒金色花叶病毒(ＰｅｐＧＭＶ)种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]烟草属(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ)普通烟草(Ｎ.ｔａｂａｃｕｍ)ＲＮＡ病毒苹果潜隐球状病毒(ＡＬＳＶ)种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[２６]烟草蚀纹病毒(ＴＥＶ)转基因烟草苗的叶:农杆菌介导的叶盘法和病毒汁液摩擦接种[１０ꎬ２７￣２８]烟草花叶病毒烟草苗的叶:体外转录后摩擦接种[２９]ＤＮＡ病毒番茄曲叶病毒(ＴｏＬＣＶ)种子苗的叶:农杆菌注射法[３０]瓦斯蒂克辣椒黄脉病毒种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]辣椒金色花叶病毒种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]卫星病毒伴随烟草花叶病毒Ｕ２株系(ＴＭＶ－Ｕ２)的卫星病毒(ＳＴ￣ＭＶ)种子苗的叶:体外转录后摩擦接种[３１]卫星ＤＮＡ中国番茄黄化曲叶病毒(ＴＹＬＣＣＮＶ)的卫星核酸ＤＮＡβ种子苗的叶:农杆菌注射法[３２]本氏烟(Ｎ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ农杆菌牙签刺伤法种子苗的叶腋:农杆菌注射法种子苗的茎:农杆菌牙签刺伤法种子苗的根:农杆菌根吸收法[５ꎬ１７ꎬ３３￣３６]０１㊀第７期曲㊀玲等:病毒诱导的基因沉默在茄科植物基因功能研究中的应用进展续表１㊀茄科植物基因功能研究中的ＶＩＧＳ载体接种的茄科植物属名种名病毒载体类型名称接种组织和方法参考文献苹果潜隐球状病毒(ＡＬＳＶ)种子苗的叶:采用寄主病毒汁液接种[３７]雀麦花叶病毒(ＢＭＶ)种子苗的叶:摩擦接种[３８]黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)种子苗的叶:体外转录后摩擦接种[３９]马铃薯Ｘ病毒种子苗的叶:农杆菌刺伤法[４０]杨树花叶病毒(ＰｏｐＭＶ)种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ质粒直接摩擦接种[４１]李痘病毒(ＰＰＶ)转基因烟草苗的叶:农杆菌介导的叶盘法ꎻ病毒汁液摩擦接种[４２￣４４]番茄花叶病毒(ＴｏＭＶ)种子苗的叶:体外转录后机械摩擦接种[３]烟草花叶病毒和番茄花叶病毒(ＴＭＶ－Ｕ１和ＴｏＭＶ－Ｆ)种子苗的叶:体外转录后机械摩擦接种[４５]烟草花叶病毒种子苗的叶:体外转录后机械摩擦接种[４６]番茄丛矮病毒(ＴＢＳＶ)种子苗的叶:体外转录后摩擦接种[４７]葡萄阿尔及利亚潜伏病毒(ＧＡＬＶ)种子苗的叶:体外转录后摩擦接种ꎻ农杆菌注射渗透法ꎻ农杆菌真空浸透法[４８]卫星ＲＮＡ竹花叶病毒(ＢａＭＶ)卫星ＲＮＡ种子苗的叶:载体直接摩擦接种ꎻ农杆菌注射渗透法[４９]卫星ＤＮＡ中国番茄黄化曲叶病毒的卫星核酸ＤＮＡβ种子苗的叶:农杆菌注射法[３２]贝因迪黄脉花叶病毒(ＢＹＶＭＶ)的卫星ＤＮＡ(β－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ)种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[５０]ＤＮＡ病毒番茄金色花叶病毒(ＴＧＭＶ)种子苗的叶:基因枪轰击ꎻ质粒机械摩擦接种ꎻ农杆菌接种[２５ꎬ５１￣５２]苘麻花叶病毒(ＡｂＭＶ)种子苗的叶:基因枪轰击ꎻ农杆菌刺伤接种[５３]非洲木薯花叶病毒(ＡＣＭＶ)种子苗的叶:基因枪轰击[５４]甘蓝曲叶病毒(ＣａＬＣｕＶ)种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]烟草属(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ)其他烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｐｐ.)克利夫兰氏烟草(Ｎ.ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ)ꎻ蓝茉莉叶烟草(Ｎ.ｐｌｕｍｂａｇｅｎｉｆｏｌｉａ)ꎻ黏烟草(Ｎ.ｇｌｕｔｉｎｏｓａ)ꎻ渐狭叶烟草(Ｎ.ａｔｔｅｎｕａｔａ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[５ꎬ１９ꎬ５５]黏烟草(Ｎ.ｇｌｕｔｉｎｏｓａ)ꎻ西方烟草(Ｎ.ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ)ＲＮＡ病毒苹果潜隐球状病毒种子苗的叶:采用寄主病毒汁液接种[３７]特大管烟草(Ｎ.ｍｅｇａｌｏｓｉ￣ｐｈｏｎ)ꎻ克利夫兰氏烟草(Ｎ.ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ)ＲＮＡ病毒杨树花叶病毒种子苗的叶:质粒直接摩擦接种[４１]番茄属(Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉ￣ｃｏｎ)番茄栽培种(Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐ￣ｅｒｓｉｃｕｍＬ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ叶面直接喷洒法[５ꎬ１７ꎬ５６￣５８]１１河南农业科学第４７卷续表１㊀茄科植物基因功能研究中的ＶＩＧＳ载体接种的茄科植物属名种名病毒载体类型名称接种组织和方法参考文献种子苗:根吸收法果实:农杆菌注射果实苹果潜隐球状病毒种子苗的叶:采用寄主病毒汁液接种[３７]马铃薯Ｘ病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[２１]ＤＮＡ病毒甜菜曲顶病毒(ＢＣＴＶ)种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[５９]番茄曲叶病毒种子苗的叶:农杆菌注射法[３０]卫星ＤＮＡ中国番茄黄化曲叶病毒的卫星核酸ＤＮＡβ种子苗的叶:农杆菌注射法[３２ꎬ６０]番茄野生种:醋栗番茄(Ｓ.ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍＬ.)ꎻ秘鲁番茄(Ｓ.ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍＬ.)ꎻ契斯曼尼番茄(Ｓ.ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法[５]辣椒属(Ｃａｐｓｉｃｕｍ)辣椒(Ｃａｐｓｉｃｕｍｓｐｐ.)ＲＮＡ病毒烟草脆裂病毒种子苗的叶:农杆菌注射渗透法ꎻ种子苗:根吸收法ꎻ[１７ꎬ２３ꎬ６１￣６４]ＤＮＡ病毒瓦斯蒂克辣椒黄脉病毒种子苗的叶:基因枪轰击ꎻ质粒机械摩擦接种[２５ꎬ６５]辣椒金色花叶病毒种子苗的叶:质粒机械摩擦接种[２５]㊀㊀其中主要包括:正链ＲＮＡ病毒ꎬ比如马铃薯Ｘ病毒㊁烟草脆裂病毒㊁烟草花叶病毒等单分体或双分体病毒[８ꎬ６６]ꎻ双生病毒科的单链ＤＮＡ病毒ꎬ其含有单组分或双组分ＤＮＡꎬ如甜菜曲顶病毒[５９]㊁番茄金色花叶病毒[５２]㊁非洲木薯花叶病毒[５４]㊁番茄曲叶病毒[３０]和瓦斯蒂克辣椒黄脉病毒[６５]等环状单链ＤＮＡ病毒ꎮ另外还有一种由ＲＮＡ病毒的卫星病毒或单组分双生病毒的卫星ＤＮＡ构建的ＶＩＧＳ载体ꎬ如Ｇｏｓｓｅｌ 等[３１]利用烟草花叶病毒Ｕ２株系(ＴＭＶ－Ｕ２)和其伴随卫星病毒(ＳＴＭＶ)建立的卫星病毒诱导的基因沉默系统(Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎬＳＶＩＳＳ)ꎬ该系统的主要优点在于将病毒的复制运动组分与沉默诱导组分相分离ꎬ使得系统的基因沉默效果更加高效和稳定ꎮ卫星ＤＮＡ主要有中国番茄黄化曲叶病毒的卫星核酸ＤＮＡβ[３２]ꎬ贝因迪黄脉花叶病毒卫星ＤＮＡβ[５０]ꎬ其优点在于卫星ＤＮＡβ的ＶＩＧＳ载体在沉默目标基因时植株不出现病毒症状ꎻ此外ꎬ还有基于烟草曲茎病毒(Ｔｏｂａｃｃｏｃｕｒｌｙｓｈｏｏｔｖｉｒｕｓ)伴随的卫星ＤＮＡβ[６７]和卫星Ａｌｐｈａｓａｔｅｌｌｉｔｅ(即ＤＮＡ１)构建的ＶＩＧＳ载体[６８]ꎬ上述卫星ＤＮＡ用于ＶＩＧＳ具有不产生病毒症状㊁基因沉默效率高且稳定持久㊁能够抑制分生组织基因表达及遗传操作容易等优点ꎬ在本氏烟㊁番茄㊁普通烟草㊁矮牵牛等茄科植物上均得到了有效应用ꎮＶＩＧＳ载体是经过基因工程技术改造后的病毒ꎬ因此每个ＶＩＧＳ载体只能有效引起一定范围植物的基因沉默ꎬ构建载体时病毒的选择对能否高效诱导基因沉默至关重要ꎬ理想状况是ꎬ选择的病毒应该没有或产生很轻的病毒症状ꎬ不影响沉默表型的观察ꎬ在插入外源ＤＮＡ片段后能保持良好的侵染性ꎬ无沉默抑制子ꎬ沉默高效持久ꎬ可侵染包括分生组织的各种组织ꎬ可均匀扩散积累于寄主植物各器官组织ꎬ具有广寄主范围等特点[９]ꎮ此外ꎬ在ＶＩＧＳ载体构建时ꎬ外源插入片段的长度范围㊁特征㊁区域选择及其与靶基因的同源性等都对沉默效率有很大的影响ꎬ应根据所选病毒种类㊁沉默植物和组织类型㊁目标靶基因以及研究目的进行优化ꎮ总之ꎬ要协调病毒在植物寄主体内的复制传播和植物生长发育之间的动态平衡ꎬ必须注意确定最优接种方式和植物生长环境条件[６９]ꎬ保证沉默信号分子可在植物体内进行系统性扩散和扩增放大[７０]ꎬ确保系统性沉默的高效持久ꎮ３㊀ＶＩＧＳ在茄科植物基因功能解析研究中的应用３.１㊀茄科植物生长发育与品质分子调控相关基因的功能研究由于ＶＩＧＳ是一种不需要遗传转化的转录后基因沉默技术ꎬ目标基因沉默后的表型和生理生化指标变化在植株当代短期内即可观察和测量ꎬ因此可便捷地鉴定果实发育㊁成熟和花器官发育等性状相关调控基因的功能ꎮＭｕｔＳＨｏｍｏｌｏｇ(ＭＳＨ１)基因编２１㊀第７期曲㊀玲等:病毒诱导的基因沉默在茄科植物基因功能研究中的应用进展码蛋白质定位于叶绿体和线粒体ꎬ主要功能是维持线粒体基因组稳定性[７１]ꎮ杨晓东[７１]通过基于烟草脆裂病毒载体的ＶＩＧＳ体系ꎬ在本氏烟和番茄上实现了ＭＳＨ１基因的沉默ꎬ证明ＭＳＨ１基因可调控植物发育重编程ꎮ另外ꎬ发育相关基因的突变有可能使植株死亡ꎬ由于ＶＩＧＳ体系是一种瞬时表达技术ꎬ为分析发育相关的致死基因功能提供了一个有利的工具ꎮＰｅｅｌｅ等[５２]利用双生病毒番茄金色花叶病毒的ＤＮＡＡ和ＤＮＡＢ为基础构建载体ꎬ在本氏烟中研究了在分生组织中高度表达的胚胎发育必需基因ＰＣＮＡ的功能ꎬ证明双生病毒ＶＩＧＳ载体可在全植株实现分生组织功能相关基因的沉默ꎮ番茄果实发育成熟调控机制是茄科植物果实发育研究中最为深入的ꎬ孔俊花[７２]采用ＰＶＸ－ＶＩＧＳ体系ꎬ揭示了番茄中首个调控果实成熟的表观遗传调控转录因子ＬｅＳＰＬ－ＣＮＲ的作用机制ꎮ另外ꎬ叶绿素降解代谢关键酶基因ＰＡＯ和半胱氨酸蛋白酶基因ＣＰ是叶片衰老相关基因[７３]ꎬ肖怀娟[７３]利用ＴＲＶ重组载体ꎬ揭示了辣椒ＣａＣＰ基因和ＣａＰＡＯ基因在激素脱落酸(ＡＢＡ)和非生物逆境胁迫下ꎬ具有正调控叶片衰老和叶片自然衰老进程的功能ꎮ运用ＶＩＧＳ技术ꎬ在茄科植物中一系列开花相关和花器官发育相关基因的功能陆续被验证ꎮ吉姣姣[７４]阐明了与辣椒保持系中线粒体正常ａｔｐ６－２基因抑制线粒体ＡＴＰａｓｅ水解活性相反ꎬ不育系中突变基因Ψａｔｐ６－２促进了线粒体ＡＴＰａｓｅ水解活性ꎬ导致辣椒细胞质雄性不育ꎮ曹凯[７５]证明了番茄ＦＴ－ｌｉｋｅ开花相关基因ＳｌＳＰ５Ｇ为长日照条件下的开花抑制基因ꎬ而ＳｌＳＰ５Ｇ２和ＳｌＳＰ５Ｇ３基因在短日照条件下抑制番茄开花ꎮＤｏｎｇ等[７６]利用构建的免连接克隆载体ＴＲＶ－ＬＩＣꎬ在本氏烟中验证了调控花器官发育的番茄ＳｌＭＡＤＳ１基因和其本氏烟中的同源基因ＮｂＭＡＤＳ４－１和Ｎｂ￣ＭＡＤＳ４－２的功能ꎬ并且证明ＮｂＭＡＤＳ４－１和Ｎｂ￣ＭＡＤＳ４－２的功能是非冗余的ꎮ另外ꎬ马宁等[７７]构建了控制辣椒花发育基因ＰＡＰ３的ＴＲＶ－ＶＩＧＳ载体ꎬ为解析调控花瓣和雄蕊发育的同类辣椒基因功能提供了ＶＩＧＳ载体体系ꎮ此外ꎬ在茄科植物品质分子调控相关基因功能研究领域ꎬＴｉａｎ等[７８]通过ＴＲＶ－ＶＩＧＳ体系ꎬ以辣椒果实为植物材料ꎬ证明了辣椒红素合成通路中的限速酶Ｃｃｓ基因以及其他３个关键酶基因Ｐｓｙ㊁Ｌｃｙｂ㊁Ｃｒｔｚ均与辣椒红素合成有关ꎬ为改良辣椒品质提供了基因资源ꎮ３.２㊀茄科植物代谢产物生物合成途径调控基因的功能鉴定应用ＶＩＧＳ技术ꎬ在茄科植物中ꎬ一系列初生代谢和次生代谢调控中的相关基因的功能得到验证ꎮ主要包括光合反应过程中必需色素的合成代谢㊁酚类次生代谢物生物合成㊁萜烯类化合物代谢调控㊁生物碱生物合成途径中的多种关键基因功能的解析ꎮ八氢番茄红素脱饱和酶(ＰｈｙｔｏｅｎｅｄｅｓａｔｕｒａｓｅꎬＰＤＳ)基因是类胡萝卜素代谢途径中的重要关键酶基因之一ꎬ在光合作用过程中ꎬ类胡萝卜素具有防止光化学反应中叶绿素的光氧化㊁保护叶绿素分子的作用ꎮ自Ｋｕｍａｇａｉ等１９９５第一次利用烟草花叶病毒在烟草中建立ＶＩＧＳ系统以来ꎬＰＤＳ基因一直作为指示ＶＩＧＳ体系是否成功建立的报告基因ꎬ该基因ｍＲＮＡ的沉默降解会引起植物叶片㊁果实和花等器官出现变白或变黄的现象ꎬ目前已普遍在茄科的茄属(Ｓｏｌａｎｕｍ)[７９]㊁辣椒属(Ｃａｐｓｉｃｕｍ)[７４]㊁番茄属(Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ)[１７ꎬ２１]㊁烟草属(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ)[５]㊁曼陀罗属(Ｄａｔｕｒａ)[１５]㊁枸杞属(Ｌｙｃｉｕｍ)[１４]㊁酸浆属(Ｐｈｙｓａ￣ｌｉｓＬ.)[８０]㊁天仙子属(ＨｙｏｓｃｙａｍｕｓＬ.)[８１]㊁颠茄属(ＡｔｒｏｐａＬ.)[８２]㊁碧冬茄属(ＰｅｔｕｎｉａＪｕｓｓ.)[１７ꎬ８３]植物中用于ＶＩＧＳ体系的建立与优化研究ꎮ在生物碱生物合成和代谢调控途径相关基因的功能验证研究方面ꎬＴａｋｉｚａｗａ等[８４]利用番茄花叶病毒载体在本氏烟中研究了腐胺Ｎ－甲基转移酶(ＰＭＴ)基因的功能ꎬＰＭＴ基因是烟碱和托品烷类生物碱生物合成的关键调控酶基因ꎬ其主要在根中表达ꎬ研究发现ꎬ在本氏烟叶中接种重组ＶＩＧＳ载体体外转录物诱导基因沉默后ꎬ不但抑制了根中ＰＭＴ基因ｍＲＮＡ的积累水平ꎬ而且还降低了地上部叶中的烟碱积累含量ꎮ植物细胞色素Ｐ４５０酶是植物中参与生物碱㊁萜烯类㊁黄酮等多种次生代谢产物生物合成和代谢调控的一个蛋白质家族ꎮＬｉ等[８５]基于ＴＲＶ－ＶＩＧＳ载体体系ꎬ证明了埃及天仙子(Ｈｙｏｓｃｙａ￣ｍｕｓｍｕｔｉｃｕｓＬ.)中的１个细胞色素Ｐ４５０基因(ＣＹＰ８０Ｆ１)的编码产物具有催化海螺碱(Ｌｉｔｔｏｒｉｎｅ)生成莨菪碱(Ｈｙｏｓｃｙａｍｉｎｅ)的功能ꎮ此外ꎬＢｅｄｅｗｉｔｚ等[８２]和李笑等[８１]采用ＴＲＶ－ＶＩＧＳ技术分别在颠茄(ＡｔｒｏｐａｂｅｌｌａｄｏｎｎａＬ.)和天仙子(Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓｎｉ￣ｇｅｒＬ.)中诱导了Ａｂ－ＡｒＡＴ４和ＨｎＡｒＡＴ３基因的沉默ꎬ研究结果证明了这２个芳香族氨基酸氨基转移酶基因分别参与了颠茄和天仙子中莨菪烷生物合成途径的调控ꎮ萜类次生代谢产物是数量最为丰富的植物代谢物质之一ꎬ利用ＶＩＧＳ技术ꎬ鉴定了多种萜类代谢调控途径中关键基因的功能ꎮ牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ＧＧＰＰ)是植物中类胡萝卜素㊁赤霉素㊁脱落酸和二萜的前体化合物ꎬ其在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸３１河南农业科学第４７卷合成酶(ＧＧＰＰＳ)的催化下合成ꎬＧＧＰＰＳ是萜类生物合成途径上的关键合成酶ꎬ魏攀等[８６]从普通烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ)中克隆到了１个ＮｔＧＧＰＰＳＬ新基因ꎬ经序列比对分析其应该为普通烟草ＧＧＰＰＳ小亚基基因的类似基因ꎬ利用ＴＲＶ－ＶＩＧＳ系统在本氏烟中证明该基因确实为叶绿素和类胡萝卜素生物合成途径中的参与基因ꎮ番茄红素是一种典型的四萜类类胡萝卜素ꎬ是类胡萝卜素生产途径上生物合成紫黄质㊁叶黄素㊁玉米黄素㊁新黄质㊁α－胡萝卜素㊁β－胡萝卜素等类胡萝卜素和脱落酸㊁独脚金内酯等植物激素的重要代谢中间化合物ꎮＦａｎｔｉｎｉ等[８７]利用基于烟草脆裂病毒的ＶＩＧＳ载体系统在番茄果实中沉默了９个候选基因:八氢番茄红素合成酶基因ＰＳＹ１㊁ＰＳＹ２㊁ＰＳＹ３ꎬ２个脱饱和酶基因ＰＤＳ和ＺＤＳ(ζ－胡萝卜素脱饱和酶基因)ꎬ以及类胡萝卜素异构酶基因ＺＩＳＯ(ζ－胡萝卜素异构酶基因)和原番茄红素异构酶基因ＣｒｔＩＳＯ㊁ＣｒｔＩＳＯ－Ｌｉｋｅ１和ＣｒｔＩＳＯ－Ｌｉｋｅ２ꎬ并分析了不同代谢阶段沉默果实中主要类胡萝卜素异构体的组成和含量变化ꎬ结果表明ꎬＰＳＹ１㊁ＰＤＳ/ＺＩＳＯ以及ＺＤＳ/ＣｒｔＩＳＯ为番茄红素生物合成途径中的３个功能单元ꎮ辣椒红素(Ｃａ￣ｐａｓｎｔｈｉｎ)是辣椒果实中的主要红色着色物质ꎬ也是类胡萝卜素代谢途径在辣椒果实中的最终代谢化合物ꎬ其是由番茄红素在番茄红素β－环化酶(ＬＣＹＢ)作用下生成β－胡萝卜素后ꎬ在多个酶的依次催化下合成的ꎬ其中辣椒红素/辣椒玉红素合成酶(ＣＣＳ)是一个主要的关键酶[８８]ꎮ田士林[８９]采用ＴＲＶ－ＶＩＧＳ系统单个或同时沉默了辣椒红素生物合成途径中的重要调控酶基因ꎬ包括Ｃｃｓ基因㊁Ｐｓｙ基因(八氢番茄红素合成酶基因)㊁Ｌｃｙｂ基因和Ｃｒｔｚ基因(β－胡萝卜素羟化酶基因)ꎮ结果表明ꎬ被沉默的辣椒果实与对照相比这些基因表达显著受到抑制ꎬ同时β－胡萝卜素㊁β－隐黄质㊁玉米黄质特别是辣椒红素的含量与正常果实相比显著降低ꎬ绿色果实不能正常变红ꎬ从而阐明了抑制类胡萝卜素代谢途径中相关关键酶基因的表达ꎬ可以阻止辣椒果实变色的机制ꎮ另外ꎬ脱落酸㊁甾醇类物质油菜素内酯等植物激素也属于萜类化合物的衍生物ꎬ参于调节植物的多个生长发育进程ꎮＡＢＡ是β－胡萝卜素生成玉米黄素后ꎬ在玉米黄素环氧酶(ＺＥＰ)㊁９－顺式－环氧类胡萝卜素双加氧酶(ＮＣＥＤ)等酶催化下合成的萜类植物激素ꎮ孙宇飞[９０]利用ＶＩＧＳ技术在番茄中分别验证了ＡＢＡ合成途径上的限速酶基因ＳｌＮＣＥＤｓ和降解过程中的关键酶基因ＳｌＣＹＰ７０７Ａｓ(ＡＢＡ－８ᶄ－羟化酶基因)的功能ꎬ结果表明两基因对ＡＢＡ代谢途径和果实成熟调控相关基因的表达均产生了影响ꎬ对番茄的成熟分别起到促进和抑制作用ꎮ油菜素甾醇类(ＢｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓꎬＢＲｓ)植物激素包括油菜素内酯(ＢｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅꎬＢＬ)等多个种类ꎬ是植物的六大激素之一ꎬ具有增强植物抵抗生物与非生物逆境胁迫㊁调控植物根茎叶生长和发育繁殖等生理作用[９１]ꎮＢｕｒｇｅｒ等[９２]分离了普通烟草中的２个钝叶醇－１４α－脱甲基酶基因ＮｔＣＹＰ５１－１和ＮｔＣＹＰ５１－２ꎬ并利用ＰＶＸ－ＶＩＧＳ体系在本氏烟中沉默了ＮｔＣＹＰ５１－１基因ꎬ结果沉默植株与对照相比ꎬＣＹＰ５１酶催化底物钝叶醇的量显著增多㊁植株生长矮化ꎬ证明该基因参与烟草ＢＲｓ生物合成途径ꎮ植物中另一类重要的次生代谢产物是酚类天然产物ꎬ主要包括类黄酮㊁简单酚酸㊁木质素等物质ꎬ在植物中酚类物质执行广泛的生理作用ꎬ包括调节植物新陈代谢和生长发育㊁使植物器官呈现颜色㊁吸收紫外线㊁抗逆境胁迫等ꎮ目前ＶＩＧＳ技术在茄科植物中已经用于酚类物质ꎬ特别是类黄酮次生代谢物生物合成途径中的多个关键酶基因功能的研究ꎮ刘和平[９３]采用ＴＲＶ－ＶＩＧＳ体系研究矮牵牛发现ꎬＰｈＡＣＣ１㊁ＰｈＡＣＣ２和ＰｈＡＡＥ１３３个基因对矮牵牛花青素的生物合成起到关键的调控作用ꎻ陶小荣等[９４]利用中国番茄黄化曲叶病毒的ＤＮＡ－Ａ与其卫星ＤＮＡ构建ＶＩＧＳ载体并对其进行了改良ꎬ在矮牵牛中成功证明了类黄酮代谢途径中的关键酶 查尔酮合成酶(Ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ)基因ＣＨＳ的功能ꎮＰａｎｄｅｙ等[９５]运用烟草脆裂病毒在渐狭叶烟草(Ｎｉｃ￣ｏｔｉａｎａａｔｔｅｎｕａｔａ)中证明了转录因子基因ＭＹＢ是芦丁和绿原酸生物合成途径上的关键调控基因ꎮＨｏｆｆｍａｎｎ等[９６]利用ＶＩＧＳ技术在本氏烟中验证了木质素生物合成途径中的一个重要调控酶基因ＨＣＴ的生物学功能ꎮ通过ＴＲＶ－ＶＩＧＳ体系ꎬ朱峰等[９７]和芦亮亮等[９８]还分别在本氏烟和番茄中鉴定了水杨酸代谢调控和维生素Ｅ合成途径中的相关重要基因的功能ꎮ３.３㊀茄科植物防御真菌病害信号传导路径中抗性相关重要基因的功能解析近几年来ꎬ伴随ＶＩＧＳ体系的越来越多样化和愈加高效稳定ꎬＶＩＧＳ技术在茄科植物应答生物与非生物胁迫信号调控网络中关键基因的功能鉴定方面也得到了有效应用ꎮ其中包括植物－真菌互作㊁植物－细菌互作㊁抗病毒㊁抗线虫㊁抗植食性害虫以及耐热㊁抗旱等逆境胁迫响应信号通路中的重要基因ꎮ以下主要对茄科植物与真菌病原菌互作研究领域相４１。
病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展张新华;李富军【摘要】Virus-induced gene silencing (VIGS) is a recently discovered post-transcriptional gene silencing, which is a natural plant antiviral mechanism. It has been developed as a new reverse genetics technique designed to rapidly characterize the function of plant genes. The approach has many advantages compare with normal plant transformation,such as no necessity to construct the transgenic plants, simplicity and rapid-ness to obtain phenotype. Therefore, VIGS has been used widely in plants for analysis the functions of genes involved in processes such as disease resistance,abiotic stress,cellular signaling,growth and development. This paper reviewed the mechanisms of VIGS,its major procedures,its application to the function a-nalysis of plant gene and current troubles.%病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象,是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制.现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术.与传统的植物转基因技术相比,VIGS无需构建转基因植株,而且具有操作简便、获得表型快速等优点,目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究.该文就VIGS 技术的作用机理、主要操作规程、在植物基因功能研究方面的应用以及存在的问题进行综述.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】6页(P419-424)【关键词】病毒诱导的基因沉默;病毒载体;植物;基因功能【作者】张新华;李富军【作者单位】山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东淄博255049;山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东淄博255049【正文语种】中文【中图分类】Q789病毒诱导的基因沉默（virus－induced gene silencing，VIGS）是一种转录后基因沉默（post－transcriptional gene silencing，PTGS）现象，是植物体内普遍存在的遗传免疫机制［1］。
基因沉默技术的原理及应用1. 引言基因沉默技术是一种用于研究基因功能和调控机制的重要方法。
它能够通过抑制特定基因的表达来观察其对细胞和生物体的影响，为我们揭示基因在生物体内的功能和相互作用提供了有效的手段。
本文将介绍基因沉默技术的原理以及其在基础研究和应用方面的相关实验技术。
2. 基因沉默技术的原理基因沉默技术主要通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）和基因编辑技术实现。
以下将分别介绍这两种技术的原理。
2.1 RNA干扰（RNAi）RNA干扰是一种通过介导RNA分子与特定的mRNA相互作用来沉默目标基因表达的方式。
其基本原理是通过引入双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）分子，利用细胞内的RNA诱导酶（RNA-induced silencing complex，RISC）将这些RNA分子切割成小片段，并通过与靶标mRNA互补序列的结合，诱导腺苷酸转化酶（adenosine deaminase，APOBEC）催化酶将目标mRNA降解，进而抑制基因的表达。
RNA干扰技术已经得到广泛应用，主要包括以下几个方面： - 基因功能研究：通过沉默特定基因，观察其对细胞生长、分化和功能的影响，从而揭示基因功能和调控机制。
- 药物筛选：利用RNA干扰技术可以高通量筛选候选药物，加速新药研发过程。
- 疾病治疗：RNA干扰技术可用于治疗基因突变引起的疾病，例如肿瘤和遗传性疾病等。
2.2 基因编辑技术基因编辑技术可以通过改变基因组DNA的序列来实现对特定基因的沉默。
CRISPR-Cas9技术是目前最常用的基因编辑技术之一。
其基本原理是利用Cas9蛋白和RNA分子形成复合物，通过与目标基因的DNA序列互补结合，引导Cas9蛋白在目标位点上产生双链切割。
随后，细胞内自身的修复机制（如非同源末端联合修复）介导修复切割部位，导致目标基因的功能缺失或沉默。
基因编辑技术在基础研究和临床应用上具有广阔的前景，如下所示： - 基因功能验证：通过编辑特定基因，验证其对生物体生理和病理过程的影响，从而鉴定相关疾病发病机制。
