蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明

避免蛋白降解
总体规则：蛋白酶普遍存在，在提取蛋白质的步骤中，早些抑制，经常抑制
分装蛋白溶液，储存于不同的温度和不同的缓冲液中，测蛋白活性，找出最适储存条件。

冷藏，并加入稳定剂。

这些稳定剂一般都能充分保持蛋白的生物学活性。

将蛋白溶液储于50%（V/V)的甘油或悬于硫酸铵（3.2M）中，避免冻存
冰结晶会造成物理剪切及蛋白变性。

避免酶的反复冻融，如果酶需要冻存，分装成小管后冻存。

蛋白质的储存
蛋白样品在液氮中速冻，拿出后加入10-20%的甘油，长期储存
整个实验过程中，都要将蛋白样品置于冰上
从母管中吸取不同的蛋白时，都要用新鲜的枪头
不要将未用的溶液倒回母管
戴手套操作，避免蛋白交叉污染，或是蛋白酶的污染
避免剧烈的震荡，避免溶液中混入蛋白变性剂
实验的过程中应避免灰尘进入，灰尘包含60%的肌氨酸
操作过程中
操作时总是小体积小量的操作，避免污染，并且动作要快
下表为常见的蛋白酶类型及相对应的抑制剂：
a：此类蛋白酶在活性中心包含丝氨酸和组氨酸。

b：此类蛋白酶在活性中心包含半胱氨酸（巯基，-SH-）。

c：此类蛋白酶在活性中心包含金属离子（如：Zn2+，Ca2+，Mn2+）。

d：此类蛋白酶在活性中心包含天冬氨酸族。

蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

常用抑制剂PMSF PMSF即Phenylmethanesulfonyl fluoride，中文名为苯甲基磺酰氟。

分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19，纯度>99%。

常用生化试剂，用于抑制蛋白酶.【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成 1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。

如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。

【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF在水溶液中不稳定。

应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

蛋白水解酶抑制剂啊实验室常用的啊主要用于组织匀浆时用!!1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml溶于异丙醇中;3)在室温下可保存一年;4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)货号：P1262规格：100T保存：-20ºC保存，有效期12个月。

产品组成：产品名称规格保存蛋白酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)2×1mL-20ºC避光磷酸酶抑制剂混合物(50X)2×1mL-20ºC产品说明：植物细胞或组织提取物中含有许多内源性的蛋白酶、磷酸酶等，容易导致提取物中的蛋白降解或去修饰，从而影响后续的蛋白检测。

因此在提取物中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂是防止蛋白降解和去修饰的有效方法本产品用于植物细胞或组织蛋白提取的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，包含了广谱的丝氨酸、半胱氨酸和酸性蛋白酶抑制剂/氨基肽酶抑制剂，以及丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶抑制剂。

以1:50的比例把蛋白酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)以及磷酸酶抑制剂混合物(50X)加入裂解液中，即可用于植物细胞或组织蛋白的提取，并有效抑制蛋白降解适用范围：抑制植物细胞或组织提取物中的各种蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶、氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等)和磷酸酶(如丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶等)。

适用于Western Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。

使用方法：1、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物（植物样品抽提用，50X），使用时分别按照1:50的比例加入到裂解液中，混匀后即可使用。

含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。

2、由于产品中的金属蛋白酶抑制剂能与亚铁等二价金属离子形成红色或紫色的螯合物，所以产品可能呈现浅粉红色；如果裂解液或样品中含有较高浓度亚铁等二价金属离子，可能出现较深的红色，但不影响使用。

蛋白质提取‎过程中常用‎的蛋白酶和‎磷酸酶抑制‎剂详细使用‎说明转自:http://www.bioas‎/html/980.html在与蛋白相‎关的检测中‎，最关键的一‎步便是蛋白‎质的提取。

在提取的过‎程中，我们要经常‎加入以防止‎。

另外在磷酸化‎蛋白的研究‎过程中，也是必不可‎少的。

本文详细总‎结了常用的‎P MSF、 Leupe‎p tin亮‎肽素、Aprot‎i nin抑‎肽酶、Pepst‎a tin胃‎、EDTA-Na2等以及NaF‎氟化钠、Na3VO‎4原矾酸钠、Beta-glyce‎r opho‎s phat‎e甘油磷酸‎钠、Na2P2‎O4焦磷酸钠等的‎溶液配制、贮存液与工‎作液浓度及‎保存条件。

一、蛋白酶抑制‎剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白‎酶抑制剂，如胰凝乳蛋‎白酶、胰蛋白酶和‎凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋‎白酶如木瓜‎蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇‎、乙醇、甲醇和丙二‎醇里>10mg/ml。

在水溶液中不‎稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少‎9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度2‎00mM，工作浓度1‎m MLeupe‎p tin 亮肽素特性‎：抑制丝氨酸‎和半胱氨酸‎蛋白酶如胰‎蛋白酶、木瓜蛋白酶‎、纤溶酶和组‎织蛋白酶B‎。

溶解性：高度溶于水‎（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月‎。

分子量：C20H3‎8N6O4‎×1/2 H2SO4‎:475.6 C20H3‎8N6O4‎x 1/2 H2SO4‎× H2O:493.6使用：贮存浓度1‎m g/ml，工作浓度0‎.5 ug/ml (1mM)。

Aprot‎i nin抑‎肽酶特性：丝氨酸蛋白‎酶抑制剂，抑制纤维蛋‎白溶酶、激肽释放酶‎、胰蛋白酶、糜蛋白酶的‎高活性。

不抑制凝血‎酶或因子X‎。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

ripa蛋白提取方法RIPA蛋白提取方法引言蛋白质是细胞中重要的分子组成部分，它们在细胞的结构和功能中发挥着关键作用。

为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们经常需要从细胞中提取蛋白质。

RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）蛋白提取方法是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和注意事项。

材料和试剂1. RIPA缓冲液：包含盐、洗涤剂和缓冲剂，用于细胞裂解和蛋白质溶解。

2. 蛋白酶抑制剂：用于保护蛋白质免受降解。

3. 磷酸盐缓冲液：用于洗涤和溶解蛋白质。

4. 加热样品缓冲液：用于处理蛋白质样品。

步骤1. 收集细胞：将需要提取蛋白质的细胞收集到离心管中，可以通过离心将细胞沉淀下来。

2. 细胞裂解：向细胞中加入适量的RIPA缓冲液，使用离心机将细胞裂解开。

3. 离心：将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和其他杂质。

4. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是含有蛋白质的部分。

5. 添加蛋白酶抑制剂：在上清液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质的降解。

6. 震荡和冷藏：将上清液和蛋白酶抑制剂混合均匀，并在4摄氏度下冷藏片刻。

7. 离心：将上清液离心，以去除任何未溶解的细胞碎片或沉淀。

8. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是蛋白质的最终提取物。

9. 加热样品：将提取的蛋白质样品加入加热样品缓冲液中，进行蛋白质的加热处理。

注意事项1. 所有的操作应该在冷藏条件下进行，以避免蛋白质的降解。

2. 所有使用的器皿和工具都应该事先冷藏，以保持低温状态。

3. 在细胞裂解和上清液收集过程中，应尽量避免氧气的接触，以减少氧化反应对蛋白质的影响。

4. 在加热样品的过程中，应控制好加热时间和温度，以避免蛋白质的降解或变性。

总结RIPA蛋白提取方法是一种常用且有效的蛋白质提取方法。

通过细胞裂解和离心等步骤，可以得到含有蛋白质的上清液。

在提取过程中，需要注意保持低温、避免氧化和控制加热条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。

4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。

分子量：685.9使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。

EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月分子量：372.24使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。

之巴公井开创作当前位置：生物帮> 实验技巧> 生物化学技术> 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要 : 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以坚持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种经常使用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对分歧蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以坚持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种经常使用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对分歧蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

经常使用抑制剂PMSF1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml溶于异丙醇中;3)在室温下可保管一年;4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步调中加入新鲜的PMSF。

EDTA1)抑制金属蛋白水解酶;2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;3)溶液在4℃稳定六个月以上;4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。

胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶;2)1mg/ml溶于甲醇中;3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月;4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L)5)在水中不溶解。

常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度来源：原创，转载请注明发布时间：2009-10-20 查看次数：21在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。

蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotin in抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，N a3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。

对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。

蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。

溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。

p H约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。

蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。

对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。

蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。

溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B 溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。

pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明0转自:/html/980.html0在与蛋白相关的检测中，最关键的一步便是蛋白质的提取。

在提取的过程中，我们要经常加入以防止。

另外在磷酸化蛋白的研究过程中，也是必不可少的。

0本文详细总结了常用的PMSF、 Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin胃、EDTA-Na2等以及NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycerophosphate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。

一、蛋白酶抑制剂0PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mM 0Leupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

0Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

从细胞系中提取蛋白质贴壁细胞：1、对于每1×107细胞，按照100μl RIPA中加入1μl PMSF、1μl 蛋白酶抑制剂和1μl磷酸酶抑制剂的方案配制裂解液，配制后置于冰上，现配现用（注：在计算理论用量后，配制时应在理论用量基础上增加多一份裂解液，如本来要配600μl，实际就配700μl，以避免移液误差导致最后一个样裂解液不足）；2、用PBS洗三遍，以尽量去除原有的培养基；3、每个样中加入计算用量的裂解液，用干净的刮勺将细胞刮尽，将细胞悬液移入标记好的EP管中进行裂解。

在切换不同样品的时候，刮勺要在PBS里面过一下，以洗掉残留在上面的上一个样的样本。

裂解时间控制在30min左右1。

此时应开始预冷离心机，并预热金属浴至目的温度2。

整个第三步操作宜严格在冰上进行。

4、在预冷至4℃的离心机中，12000rpm离心15-20min；5、弃沉淀，转移上清至新的标记好的EP管中，加入上清体积1/4的SDS并混匀3；6、检测蛋白浓度，步骤见“测蛋白浓度.docx”7、100℃金属浴5min，而后转移至-20℃冰箱保存。

短期不行WB实验时，则应将样品转移至-80℃冰箱。

悬浮细胞：1、裂解液配制方案同前；2、对于悬浮细胞，收集细胞悬液后1200rpm×5min离心，弃上清，PBS洗，也是三遍；最后一遍洗的时候，先转移至EP管再离心是个不错的选择。

3、直接向EP管中加入计算用量的裂解液，重悬后冰上离心30min。

4、后续操作同前。

注：1、裂解时间也有人因操作失误延长至1h，实际中没有造成很大的损失，但个人意见，实验步骤还应尽量紧凑些；在中间过程中可以反复吹打，尽可能使其形成单个细胞悬浮状态，使其充分裂解。

2、常用的蛋白变性方案为100℃×5min，也有人用65℃×30min或37℃×60min，但后者实际上是对非常特殊的蛋白使用的方案，这一类蛋白富含疏水性氨基酸（包括色氨酸、缬氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，例如β-淀粉样蛋白中，上述氨基酸占比达到57%），高温时容易发生蛋白多聚化现象，形成多聚体，此时免疫印迹实验无法在目的条带检测到蛋白表达。

蛋白质提取操作流程(细胞裂解)1. 引言在生物学和生物化学研究中，蛋白质提取是一项重要的实验操作。

细胞裂解是蛋白质提取的第一步，它是将细胞破坏并释放细胞内的蛋白质。

本文档旨在说明细胞裂解的操作流程，以帮助研究人员正确、高效地执行该实验步骤。

2. 实验材料- 细胞悬液- 低渗盐溶液 (如PBS)- 细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）- 离心管- 超声细胞破碎仪或高压胞破机3. 实验步骤3.1 样品制备将培养的细胞收集到离心管中，尽量避免细胞沉积。

3.2 细胞洗涤使用低渗盐溶液（如PBS）洗涤细胞，去除培养基中的蛋白质、代谢产物和细胞碎片。

3.3 细胞裂解缓冲液添加将细胞沉淀洗涤后，用适量的细胞裂解缓冲液悬浊细胞。

细胞裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂，以防止蛋白质被降解。

3.4 细胞破碎将细胞裂解液置于超声细胞破碎仪或高压胞破机中，进行细胞破碎。

超声细胞破碎仪可通过高频声波震荡来破坏细胞膜，释放蛋白质。

高压胞破机通过高压力将细胞挤压破碎。

3.5 细胞碎屑去除使用离心机离心细胞裂解液，去除其中的细胞碎屑和细胞核，以获取纯净的蛋白质溶液。

3.6 蛋白质收集收集上一步离心后的上清液，其中包含提取的蛋白质。

将上清液转移至新的离心管中，即得到蛋白质溶液。

3.7 蛋白质浓度测定使用比色法、BCA法等方法对蛋白质溶液进行浓度测定，以获得蛋白质提取的量和浓度信息。

4. 结论通过细胞裂解的操作流程，可以高效地破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

正确的细胞裂解步骤可以确保蛋白质提取的质量和数量。

然而，在实验中需要注意的是，不同类型的细胞可能需要不同的裂解条件。

因此，在进行蛋白质提取实验时，需要根据具体情况优化裂解缓冲液的成分和细胞破碎的方法。

希望本文档能为您的实验提供有价值的指导和参考。

添加蛋白酶抑制剂是大多数细胞裂解和蛋白质提取的必要步骤。

蛋白质提取过程中，内源性蛋白酶会降解蛋白质，导致蛋白质产量的降低。

在裂解试剂中加入蛋白酶抑制剂，可防止提取蛋白的降解，确保在细胞裂解后获得蛋白质的产量。

蛋白酶抑制剂是生物或化学化合物，其作用是可逆或不可逆地结合蛋白酶。

大多数已知的蛋白酶属于四个进化上不同的酶家族之一，基于功能基团参与肽键的裂解。

一般情况下，蛋白提取过程中总是需要使用蛋白酶抑制剂。

大多数情况下，需使用几种不同抑制剂化合物的混合物（也称Cocktail,鸡尾酒），以确保蛋白质提取物在分析之前不会降解。

常见蛋白酶抑制剂
常见蛋白酶抑制剂活性组分
不可
常用蛋白酶抑制剂混合物组成
*EDTA影响蛋白活性时，需实验是否需要添加EDTA。

凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number：For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。

获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。

二、 试剂盒组份组份 KGP250 （50 tests） KGP2100（100 tests）储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF（100mM）500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。

冰上保存数分钟待用。

2． 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。

Ⅱ 培养细胞蛋白提取1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。

蛋白酶抑制剂技术原理和选择指南当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使电泳结果复杂化，影响最终结果分析。

为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低温下进行。

此外，许多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。

但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。

因此对于我们想要研究的蛋白来说，选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。

蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如PMSF 和leupeptin。

而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自《蛋白质电泳实验技术》）。

蛋白酶抑制剂有效抑制的酶PMSF(Pheylmethylsulfonylfluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1mmol/L不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。

AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低EDTA，EGTA，使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。

多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为2-20ug/ml 亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶TLCk，TPCK，使用浓度为0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）使用浓度为1-3mmol/L抑制丝氨酸蛋白酶但是这样配置溶液进行处理，有时也是颇为麻烦，而且效果可能并不好，目前有一些厂家试剂在简便操作，和抑制效果方面有不俗的表现，可以考虑在实验中选用，节约时间和便于结果分析。

当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

常用抑制剂PMSF1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml溶于异丙醇中;3)在室温下可保存一年;4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

EDTA1)抑制金属蛋白水解酶;2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;3)溶液在4℃稳定六个月以上;4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。

胃蛋白酶抑制剂(pepst anti n)l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶;2)1mg/ml溶于甲醇中;3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月;4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L)5)在水中不溶解。

蛋白酶k配制、使用方法及作用蛋白酶K是一种常用的酶制剂，具有广泛的应用领域，下面将详细介绍它的配制方法、使用方法及作用。

蛋白酶K的配制方法比较简单，一般可按照以下步骤进行：1. 准备一定浓度的蛋白酶K酶制剂。

通常我们可以购买到蛋白酶K的商业制剂，也可以从合适的菌株中提取纯化蛋白酶K。

2. 将蛋白酶K粉末溶解在适宜的缓冲液中。

常用的缓冲液可以选择0.1M Tris-HCl（pH7.5）或者PBS（磷酸盐缓冲液）等。

3. 根据实验需求，可以调节蛋白酶K的浓度。

通常浓度为10-50μg/ml之间。

蛋白酶K的使用方法主要分为两种情况：1. 蛋白酶K用于蛋白质的纯化。

在蛋白纯化过程中，蛋白酶K可以用于除去污染物中的蛋白质，如核酸、脂质等。

在纯化过程中，将蛋白酶K加入到待纯化的蛋白质溶液中，经过一定时间的反应，蛋白酶K可以选择性地降解污染物，从而提高纯化效果。

2. 蛋白酶K用于蛋白质的消化。

在一些实验中，需要将蛋白质进行部分或完全地降解，以便进一步研究其功能或结构。

蛋白酶K可以切割蛋白质链中特定的氨基酸残基，从而实现蛋白质消化的目的。

将适量的蛋白酶K加入蛋白质溶液中，经过一定时间的反应，蛋白质可以被降解成较小的片段。

蛋白酶K的作用主要有以下几个方面：1. 选择性降解污染物。

蛋白酶K在蛋白纯化过程中，具有很高的特异性，可以选择性地降解污染物，从而提高纯化效果。

2. 促进蛋白质的降解。

蛋白酶K可以选择性地切割蛋白质链中特定的氨基酸残基，从而促进蛋白质的降解，有助于进一步研究蛋白质的功能和结构。

3. 提高实验效果。

在一些实验中，特定的蛋白质消化可以提高实验效果，如Western blotting中的蛋白质转膜效果，蛋白质结构分析中的质谱检测等。

综上所述，蛋白酶K是一种常用的酶制剂，通过选择性降解污染物和促进蛋白质降解的作用，能够在蛋白质纯化和实验研究中发挥重要的作用。

在使用时，我们需要根据具体需求选择适当的配制方法和使用条件，以获得较好的实验效果。

蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。

但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

尽量要新鲜原料。

但有时这几方面不同时具备。

含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。

要事前调查制备的难易情况。

若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。

如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。

但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。

研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。

可能时尽量用全年均可采到的原料。

对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。

要剔除结缔组织及脂肪组织。

如不能立即进行实验，则应冷冻保存。

除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。

不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。

如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。