医学免疫学实验课件-实验五 中性粒细胞吞噬检测

《医学免疫学》实验课内容实验名称：中性粒细胞吞噬功能测定实验目的与要求：掌握中性粒细胞吞噬金黄色色葡萄球菌实验的操作过程；瑞氏染色的基本步骤及吞噬百分率的计算实验仪器、试剂：葡萄球菌培养液抗凝剂载玻片瑞氏染液水浴箱离心机注射器止血带消毒药水实验动物及来源：无实验原理：中性粒细胞具有非特异性的吞噬功能操作方法：1.采血：取人静脉血2毫升，放入含肝素的小试管中，混匀，防止凝血。

2.菌液制备：取葡萄球菌液，加生理盐水离心洗涤2～3次(2000r/min, 5～10min），去上清，留沉淀加入生理盐水，用比浊法配制到适宜浓度（1×107个/ml）。

3.混合温浴：将制备好的菌液0.5毫升加入到抗凝的人静脉血中轻轻混匀，置于37℃水浴箱中水浴30分钟（每10分钟轻摇匀一次）。

4.吸取混合悬液点在玻片上，制成血涂片，干燥后进行瑞氏染色，油镜下观察。

实验现象与数据：镜下可见中性粒细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的葡萄球菌呈蓝（紫）色，计数200个中性粒细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。

结果分析与结论：吞噬率＝吞噬细菌中性粒细胞/200个中性粒细胞×100%注意事项：1.菌液配备时注意无菌操作。

2.注意静脉血和菌液应按一定体积比混合，血﹕菌=5﹕1思考与创新：实验课教案实验名称：E-玫瑰花环形成实验实验目的与要求：掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法；熟悉T淋巴细胞的功能检测方法。

实验仪器、试剂：淋巴细胞分层液（Ficou）、1%绵羊红细胞、肝素抗凝人血、无钙镁Hanks液、水平离心机、0.8%戊二醛、37℃水浴箱、显微镜、其他。

实验动物及来源：无实验原理：体外测定人外周血中T淋巴细胞数量的方法有多种,以玫瑰花环试验最为简易常用，T淋巴细胞数量的变化与机体的细胞免疫功能状态有一定关系。

人周围血液中T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体，与绵羊红细胞相遇时，在其周围形成花环样细胞团，凡能结合三个以上绵羊红细胞者称为E攻瑰花环形成细胞。

中性粒细胞吞噬实验报告中性粒细胞吞噬实验报告细胞是生命的基本单位，它们在体内发挥着各种重要的功能。

其中，中性粒细胞是一类重要的白细胞，它们在机体的免疫防御中起着至关重要的作用。

为了更好地了解中性粒细胞的功能，我们进行了一项中性粒细胞吞噬实验。

实验目的：通过观察中性粒细胞对细菌的吞噬过程，探究中性粒细胞的吞噬能力以及其在免疫防御中的作用。

实验材料：1. 中性粒细胞培养液2. 细菌培养液3. 显微镜4. 培养皿5. 移液器6. 培养箱实验步骤：1. 准备中性粒细胞培养液和细菌培养液。

2. 取一块无菌培养皿，使用移液器将中性粒细胞培养液滴在培养皿中。

3. 添加适量的细菌培养液到培养皿中，使细菌均匀分布。

4. 将培养皿放入预热的培养箱中，以37摄氏度恒温培养。

5. 在各个时间点，取出培养皿，用显微镜观察中性粒细胞的吞噬情况。

6. 记录观察结果，并进行数据分析。

实验结果：经过观察，我们发现中性粒细胞对细菌的吞噬能力非常强大。

在实验开始的几分钟内，中性粒细胞迅速聚集到细菌附近，并开始将细菌吞入细胞内部。

随着时间的推移，越来越多的细菌被吞噬，中性粒细胞的数量也逐渐增加。

在实验结束时，几乎所有的细菌都被中性粒细胞吞噬。

实验分析：中性粒细胞的吞噬能力是机体免疫防御的重要组成部分。

通过吞噬细菌和其他病原微生物，中性粒细胞能够清除体内的病原体，维护机体的健康。

在实验中，我们观察到中性粒细胞对细菌的迅速吞噬过程，这证实了中性粒细胞在免疫防御中的重要作用。

中性粒细胞的吞噬过程是一个复杂的生物学过程，其中涉及到多种细胞因子和信号分子的调控。

这些因子和分子能够引导中性粒细胞朝向病原体，并促使细胞对其进行吞噬。

在实验中，我们没有对这些调控因子进行深入研究，但可以肯定的是，它们在中性粒细胞吞噬过程中发挥着重要的作用。

此外，中性粒细胞的吞噬能力也受到多种因素的影响。

例如，炎症反应和免疫系统的激活可以增强中性粒细胞的吞噬能力。

而某些疾病和病理状态则可能导致中性粒细胞吞噬功能的下降。

实验一、中性粒细胞吞噬功能测定Assay for Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocyte 【实验目的】•掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理；•熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；•通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

【实验原理】血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。

计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。

有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。

【材料和试剂】1.待测样本新鲜抗凝静脉血2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。

3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。

4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。

【操作步骤】1.白色葡萄球菌液制备。

（已制备好）2.待测血标本制备：静脉采血5ml。

3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。

4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。

5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。

6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1-2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。

7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。

【推血片方法】取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。

将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角 向后拉动推片，使与血液接触 •待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。

取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。

30°血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚良好的血片，血液应分布均匀，厚度适当。

对光观察时呈霓红色，血膜应位于玻片的中央，血膜两端留有空隙，以便注明病例编号、日期等。

中性粒细胞和巨噬细胞吞噬功能测定实验报告使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油的原理是由于自标本玻片透过的光线，因介质（玻片一空气一接物镜）密度不同，部分光线发生折射而散失（如图中A—A'）使射入物镜的光线减少，在使用高、低倍镜时，透镜的孔径比较大，影响尚不显著；但应用油镜头时，因透镜的孔径小，进入的光线则不够，致使物象显现不清。

当油镜与标本片之间加香柏油后，香柏油的折射率（n=1.515）和玻璃的折射率（n=1.52）相近似，因此可增加进入透镜的光线（如图中C—C'），使视野的亮度加强，物象也就看得清楚。

5. 瑞氏染色1）原理：瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。

瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物（天青）组成，其深于甲醇后，解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的力也不一样，因此，染色后各细胞呈现出各自的染色特点。

2）配制：（1）A液：瑞氏染粉0.1g，甲醇(AR）60ml。

将瑞氏染粉放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。

染液配好后放于室温下，一周后即可使用。

（2）B液：瑞氏染液B液为磷酸盐缓冲液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g；加蒸馏水至1000 ml使其溶解。

配好后的磷酸盐缓冲溶液应校正pH值，其范围在pH6.4～6.8即可，然后塞紧瓶口备用。

摇匀。

对小鼠进行及时止血，否则易失血过多而死亡。

3.向含血液的小试管加入菌液：向小试管加入菌液后用塑料吸管吹洗三次，充分混匀，使血液中的吞噬细胞和细菌充分接触，促进吞噬。

4.水浴：37℃水浴锅中保温20分钟，每隔10分钟取出小试管混匀1次，以使吞噬细胞与细菌充分接触和作用，促进吞噬。

（吞噬细胞的活性在接近体内温度的条件下最强，温度太高细胞活性下降且容易死亡）5.血涂片的制作：在载玻片的一端滴加一滴水浴后的血液，用另一个载玻片与载玻片间角度30°推片，用力匀，勿使太薄（白细胞多集中于边缘）或太厚（细胞重叠缩小）于玻片上影响标本的清晰度。