氨基酸营养缺陷型 2

工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。

营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。

原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。

完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。

用[＋]来表示。

补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。

摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。

关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。

2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。

二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。

本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、实验材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。

3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。

实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。

3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。

致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。

2010级生物技术曹学敏学号：2010445007 2组氨基酸营养缺陷型的筛选及鉴定实验方案一、实验目的掌握对细菌进行诱变处理的方法以及对突变体检出、鉴定和获得营养缺陷型的方法二、实验材料(一) 菌种芽孢杆菌(二)培养基完全培养基（CM）：葡萄糖0.5 g 牛肉膏0.3 g 酵母膏0.3 g 蛋白胨 1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 琼脂2g 蒸馏水100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20min。

基本培养基：（MM）葡萄糖0.5 g (NH4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠0.1 g MgSO4·7H2O 0.02 g K2HPO4 0.4 g 0.6 g 蒸馏水100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min(三)主要药品：葡萄糖牛肉膏酵母膏蛋白胨MgSO4·7H2O (NH4)2SO4 柠檬酸钠K2HPO4 KH2PO4 亚硝基胍甲酰胺磷酸青霉素20种氨基酸（鸟氨酸苯丙氨酸谷氨酸甘氨酸组氨酸亮氨酸酪氨酸丝氨酸半胱氨酸异亮氨酸色氨酸丙氨酸蛋氨酸精氨酸苏氨酸天冬氨酸胱氨酸赖氨酸脯氨酸缬氨酸）（四）主要试剂：蒸馏水0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液生理盐水：0.9g氯化钠溶于100mL蒸馏水（五）器材及仪器：pH试纸黑纸吸水纸酒精灯接种环试管250ml 锥形瓶、100ml锥形瓶培养皿试管移液管10ml离心管玻璃棒玻璃珠玻璃刮灭菌牙签培养箱摇床离心机分析天平恒温水浴锅三、实验步骤（一）实验准备1.按配方配制培养基（配制200mL基本培养基、100mL完全培养基、100mL完全培养液和50mL基本培养液）和实验中所用药品。

2．取4mL融化完全培养基于试管中，盖上棉塞；分别取20mL完全培养液于两个250mL锥形瓶；然后将剩余的完全培养基与基本培养基放于锥形瓶中高温灭菌消毒，备用。

还需取7支10mL离心管、4支1mL移液管、3支5mL移液管、1支10mL移液管、10个大培养皿、10个玻璃刮250mL锥形瓶3个进行高温灭菌，备用。

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选生命科学学院09级生物技术1班余振洋200900140156指导老师：林建群同组者：潘红芳摘要营养缺陷型菌株是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。

本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，计划通过诱变得到并筛选出营养缺陷型，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤并掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。

关键词营养缺陷，诱变，生长谱测定，大肠杆菌（E.coli）1．引言1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。

由于营养缺陷型不能合成某种末端产物，解除了合成代谢的反馈抑制作用，限量添加所需生长因子克服生长障碍后，可选择性大量合成积累所需的中间代谢产物。

因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。

营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得原养型。

1.2 紫外线诱变紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。

紫外线是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。

紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。

由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。

15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。

低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。

紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。

在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。

当细胞中的DNA分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变。

2023-2024学年天津市南开中学滨海生态城学校高二下学期第二次学习质量检测生物试卷1.从自然界中筛选具有优良性状的菌种的一般步骤为：采集样品→富集培养（使菌体数量增多）→纯种分离→性能测定，如图a、b是采用两种接种方法接种后纯化培养的效果图。

下列相关叙述正确的是（）A．可使用液体培养基进行富集培养B．为获得纯种的目的菌种，需对采集的样品进行灭菌C．获得图a所示结果的接种过程中，接种环需灼烧灭菌3次D．利用图b计算出样品中菌体浓度为5．85×10 8个/ml，则接种稀释液的稀释倍数为10 7倍2.将两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌（菌株a和b）进行如下图所示实验。

下列叙述正确的是（）A．实验中接种至培养基方法是平板划线法B．基本培养基出现的少量菌落一定是单菌落C．基本培养基中包含菌株a和b的生长因子D．菌株a和b需要的生长因子有所不同3.沙果中的有机酸、维生素含量较高，有很高的营养价值。

人们对其进行深加工，开发生产出了沙果果酒、果醋等发酵产品。

下列有关制作过程或原理的分析，错误的是（）4.北京传统小吃豆汁的制作工艺流程如图所示。

混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程中，主要的产酸微生物为乳酸菌。

下列叙述正确的是（）A．混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自老浆B．可用平板划线法测定混合浆中乳酸菌的含量C．制作豆汁的过程中，通入无菌空气有利于乳酸菌的繁殖D．绿豆乳中的蛋白质主要为乳酸菌提供碳源和能源5.60Co辐射可使部分花粉活力降低，通过受精过程可诱导卵细胞发育成单倍体幼胚。

科研人员利用此原理，通过下图所示操作培养西葫芦优良品种。

下列相关叙述不正确的是（）A．雌花套袋的目的是防止外来花粉的干扰B．经②得到的部分幼苗体细胞染色体数目可能与④获得的品种相同C．④处理可在有丝分裂前期抑制纺锤体的形成D．③应挑选幼苗中叶片大、茎秆粗壮的个体即为单倍体6.紫花苜蓿（2n＝32）是应用较为广泛的豆科牧草，但易造成家畜鼓胀病。

营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。

营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。

完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。

补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。

营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。

营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。

现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。

第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。

通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。

抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。

青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。

制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。

在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。

菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。

其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。

通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。

第三步，检出缺陷型：具体方法很多。

营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合摘要:本实验主要是筛选鉴定芽胞杆菌营养缺陷型菌株，制备原生质体并检出融合子。

以现有的枯草芽胞杆菌为材料，进行紫外诱变，并逐级筛选出某种氨基最后进行不同缺陷型菌株的原生质融合并检出融合子。

实验酸营养缺陷型菌株。

得到色氨酸营养缺陷型，原生质再生率93.3%，亲本再生率83.9%，融合率为0.74%。

故本实验所采用的一系列方法都比较适宜。

关键词:芽胞杆菌紫外诱变原生质融合枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群，是工业、农业和医药工业等领域广泛应用的一种细菌。

枯草芽胞杆菌在生长过程中产生的抗菌蛋白对动植物病原菌均有很强的抑制作用,且能提高动植物免疫抗病能力。

蛋白酶作为枯草芽胞杆菌产生的另一种有重要价值的产物,在纺织、食品、饲料、洗涤剂及皮革工业中早已发挥着重要的作用。

蛋白酶作为饲用酶制剂的重要成分,有利于提高饵料蛋白质在仔猪消化道的消化率,具有促进生长、改善健康状况等作用。

蛋白质是仔鱼、仔虾生长的主要成分之一,饵料蛋白质的质量分数高达35%-55%,但消化率却较低。

因此,蛋白酶也是鱼、虾饲料中必须添加的消化酶。

1. 实验材料1.1菌株上学期筛选出来的产蛋白酶的枯草芽孢杆菌1.2 培养基完全培养基(CM，液体)、完全培养基(CM，固体)、基本培养基(MM)、补充基本培养基(SM)、再生补充基本培养基(SMR)1.3试剂缓冲液、原生质体稳定液(SMM)、促融合剂(40,聚乙二醇(PEG-4000)的SMM液) 溶菌酶液等1.4主要仪器显微镜、台式离心机及各种微生物实验常用仪器2.实验方法2.1菌悬液制备2.1.1细胞悬浮液的制备取保藏的斜面菌种，接种到液体试管中在转接入三角瓶。

取适量培养液，离心，收集菌体，洗涤沉淀，之后将菌体充分悬浮于10mL生理盐水中 2.1.2活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度采用十倍稀释法测定细胞菌悬液的浓度。