透射电子显微镜样品的制备方法.pptx

优点：增大薄区面积； 准备定位减薄位置。
Gatan 656 凹坑仪
3. 凹坑
凹坑示意图
3. 凹坑
凹坑可用两种类型的轮子：研磨轮、抛光轮
6μm金刚石研磨膏研磨 3μm 抛光轮粗抛光 0.05μm的氧化铝抛光膏精抛光
3. 凹坑——钉轮直径和样品深度的关系
在离子减薄中，因为离子束的入射角很小，所以要注意 钉薄后样品的边缘可能会挡住样品的中心部分。
钉轮直径（D），钉薄区域（2r）和钉薄深度（d）的关 系近似为：d≈r²/D
典型的一个3mm直径样品的边缘宽0.4mm，钉薄区域的直 径为2.2mm，离子减薄时离子束入射角用4°，样品的最 大钉薄深度：1.1mm×tan4°=77（μ m）。因此样品的钉 薄深度不能大于77微米，否则离子束打不到样品中心。
树脂包埋法
包埋后的粉末样品(光学显微镜观测)
超薄切片后离子减薄的结果
二、块体样品
为什么要制样？
透射电子束一般能穿透厚度为100nm以下的薄层样品; 透射电镜样品台只可以放入直径3mm的圆片。
TEM块体样品的制备其实是个材料加工成型的 过程,要充分考虑材料本身的特性。
二、块体样品
送样要求：厚度0.2~0.3mm，10mm见方的薄片。 建议：可以将样品用线切割、砂纸磨等方式处理成上述薄片。
3. 凹坑
凹坑的意义
在制备高质量的电镜样品时，需要样品有大面积薄区， 还要有厚度的变化支持，为了达到这样的效果需要对 样品进行钉薄（凹坑），凹坑仪可以将样品的中心部 减薄至几个微米的厚度，缩短了离子减薄的时间，它 适用范围非常广泛，金属材料、陶瓷、半导体、复合 材料超导材料等。
3. 凹坑
要求：对抛光后的样品的另一面进行机械预减薄至80μm。 对圆片中间凹坑，使样品中间厚度减至 10~30μm。

固定方法—戊二醛-锇酸双固定
双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品 进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定 的方法称为双固定法。 先用2.5%戊二醛固定2h以上。 缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/ 次）。
1%锇酸固定2h。
3脱水
透射电镜的结构 透射电镜主要由电子光学系统、 真空系统和供电系统三部分组成。其 中电子光学系统通常称为镜筒，是透 射电子显微镜的核心，它又可以分为 照明系统、成像系统和观察记录系统。
TEM
电子光学系统（镜筒） 供电系统 真空系统
照明部分
成像放大部分
显像部分
电子枪：TEM电子源
物镜、中间镜、投影 镜
理想固定剂
1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部 位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化 2）稳定细胞成分和结构，以保证后续的各种处理中物 质不溶解、不丢失 3）对细胞超微结构没有损伤，保证电镜图像的真实性 4）能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5）最好提供一定的反差 ,并有防腐作用
切片操作步骤： 装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片
切片厚度的判断
颜色 暗灰色 铅灰色 银灰或银白 米黄、金黄 紫色(蓝) 厚度(Å) <400Å 400~500 500~700 700~1000 1000以上 切片 厚度 太薄 较薄 适中 较厚 不能用 分辨 率 高 高 好 低 反差 小 小 好 好
常用固定剂
1）锇酸（OsO4)
优点： ⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良 好 ⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 ⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好 锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固 定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积

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清洗
• 组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液 • 残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。 • 锇酸可与乙醇作用生成沉淀。 • 清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲
液）
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脱水
去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备
含水样品在电镜高真空状态下观察反差极低
与CO2接触会形成不溶性 碳酸铅沉淀 10min左右
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半薄切片制作
• 可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。 • 修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺蓝染色观察。
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超薄切片制样程序
• 取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
4.99 9.98 14.97 19.96 24.95 1.24 2.48 3.72 4.96 6.2 3.77 7.54 11.31 15.08 18.85 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 5.14 10.28 15.42 20.56 25.7 0.62 1.24 1.86 2.48 3.1 4.24 8.48 12.72 16.96 21.2 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 4.85 9.7 14.55 19.4 24.25 1.85 3.7 5.55 7.4 9.25 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85
固化剂：控制软度 固化剂：控制硬度 加速剂
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从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫 取材。 1、取材的方法
动物和植物的取材方法稍有不同。 动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动物，然 后要在尽短的时间内（要求在１分钟之内）把所需 要的组织取出放入预冷（ 40C ）的固定液中，稍加
固定后再切成适当大小的块(要求１立方毫米大小）；
植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大小的
2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。 1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物理手段，
使细胞结构固定，一般不用。
2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进行 固定，是常用的方法。
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化学固定又可分为：
（1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定， 这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电镜 细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。
（2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固定剂 对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。它可以 相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结构都得到 充分的固定。
（3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用 的方法，可以防止细胞的自溶。
（4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种临时固
然干燥。 保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。
B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微小动、植物体的包埋。
如果选择的包埋剂不合适，在固化后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。
磷酸二氢钠（含1个水分子）
27.60g
(含2个水分子）
加双蒸水至
31.21g 1000ml
不同PH的0.2M 的磷酸缓冲液的配制

Ar+
薄膜样品制备
Ar+
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超薄切片法（了解)
薄膜样品制备
用超薄切片机可获得50nm左右的薄样品。 主要用于生物试样的薄片制备和比较软的无机材料
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总结
透射电子显微镜样品制备主要方法：
支持膜法
表面复型及 萃取复型
薄膜样品 制备
火棉胶 AC纸 碳膜
塑料一次复型 碳一次复型 二次复型 萃取复型
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薄膜样品制备步骤：
① 切取薄片（厚度<0.5mm） ② 预减薄：用机械研磨、化学抛光、电解抛
光减薄成“薄片”（0.1mm） ③ 终减薄：用电解抛光、离子轰击减薄成
“薄膜”（<500nm） 避免引起组织结构变化，不用或少用机械
方法。终减薄时去除损伤层。
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终减薄方法
双喷式电解抛光减薄
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② 二级复型
先一次复型，然后进行二 次碳复型，把一次复型溶去， 得到第二次复型。
为了增加衬度可在倾斜 15-45°的方向上喷镀一层 重金属，如Cr、Au等。
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复型法
二级复型的特点：
优点： 1） 制样简便； 2）不破坏试样表面 3）中间复型为塑料（较厚）较易剥离 4）观察膜为碳膜，导电性好（如投影重金
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薄膜样品制备
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氩离子减薄法
薄膜样品制备
原 理：在一定的真空条件下，氩气在高 压下发生电离，氩离子流以一定的入射角 轰击样品，当离子的能量高于样品材料表 面原子的结合能时，样品表层原子发生溅 射。穿孔后，供观察。

图2.8 K-3镍基合金中σ相的二级复型电子像
2.1.3 抽取复型
抽取复型是对一级复型步骤稍加改进的方法，它就不仅 能用复型显示样品表面浮凸而且可用膜抽取出某些细小的组 成相，例如第二相粒子，并能保持它们在样品中原有的分布。
它的最大优点是这些小粒子除了能在透射电子显微镜下被观
察其大小、形态分布之外，还能通过电子衍射的方法确定其 物相。抽取复型可以用碳蒸膜也可以用塑料膜，目前常用碳 蒸发膜，其具体制备方法如下:
图2.9 奥氏体钢（0.3％C，36％Ni，1.0％Cr）
1473 K，1 h＋水淬＋1 173 K，30h＋水淬，在-77 K拉伸断裂，碳抽取复型，10 000×
2.2 粉末样品和薄膜制备
• 2.2.1 粉末样品
粉末样品的制备包括支持膜的制备和粉末均匀分布于支 持膜上的方法。对于细小的粉末或颗粒，因不能直接用电子
表面的第二相粒子与基体分离。
• 将分离后的碳膜转移到某种化学试剂中洗涤，溶去残留的基体，最后 移到酒精中去洗涤，用样品铜网捞起，干燥后即可供观察。
2.1.3 抽取复型
图2.9是奥氏体钢塑 性断裂断口的碳抽取复
型，断口上的微坑特征
依稀可见。经电子衍射 鉴定，被抽取的粒子是
(Cr,Fe)7C3型碳化物。
格，然后浸入适当的化学试剂中作第二次浸蚀或电解抛光，使碳膜与金
相试样表面分离。 • 用样品铜网将碳复型捞起烘干即可放到透射电子显微镜中观察。
2.1.1 一级复型
图2.5 碳一级复型制备及其图像衬度
2.1.1 一级复型
图2.6 K-3镍基高温合金中σ相的碳一级复型图像
2.1.2 塑料-碳二级复型
显微镜样品铜网来承载，需在铜网上预先粘附一层连续而且

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切片带弯曲可能原因及解决办法
可能原因 梯形或矩形组织面上下边不平行 刀刃锋利程度不一 组织面上边或下边与刀刃不平行
解决办法 用双面刀片重新休整组织切面使之平行 更换新玻璃刀 重新调整组织与刀刃距离，使之平行
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支持膜的制作
支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度 约20nm。性能良好的支持膜应具备： 1.较高的透明度 2.在电镜下无可见结构 3.与所支持的各种样品不发生化学反应
无皱折、刀痕、震颤等缺陷。 • 样品反差良好，无染色沉淀。 • 支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。
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六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合，来提高结构成分散射电子 的能力，从而增加图像反差的染色，又称为
正染色。
• 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
❖染色步骤
复膜载网－滴样品-滴染1-2min－用滤纸 吸去染液－观察
❖优点
适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他 微生物、大分子、分离细胞器）
操作快速、简便 样品用量少 图像结构反差好
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小结：（超薄切片） 1.取材:要求部位准确,块小,时间短,低温,器械锋利, 减小机械损伤. 2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过 一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充 分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太长. 3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水, 一般50%,70%,80%,95%,无水酒精, 4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底. 5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60 度顺序. 6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需 要注意. 7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.

理，防止电荷积累。
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透射电子显微镜样品制备
离子减薄法 优点：易于控制，可以提供大面积的薄区。 缺点：速度慢，减薄一个样品需十几个小时到 几十个小时。
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Байду номын сангаас
透射电子显微镜样品制备
复型法
a.对物体表面特征进行复制的一种制样方法。
b.目的在于将物体表面的凹凸起伏转换为复型材 料的厚度差异，然后在电镜下观察，设法使这种 差异转换为透射电子显微像的衬度高低。
射而产生衍射现象，其原理与x射线衍射作用 相同，获得的衍射图案相似。 2. 遵从衍射产生的必要条件和系统消光规律。
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类似于x射线，衍射束强度和晶面关系:
Ihkl Fhkl 2
结构因子表征晶体中点阵晶胞内所有原子散射波 在衍射方向上的合成，表达为:
n
F h kl fje2 xih p j x kj y ljzfjex 2ip g r j
根据获得的电子衍射谱计算几个重要斑点相应晶面的间距d然后查已知范围内的晶体的x射衍射谱卡片以确定出相同衍射花样规律最后再进行计算核对是否相符合同时还要标出衍射斑点的指数和晶带方向此过程相当于电子衍射的物相分析
透射电子显微镜-TEM
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内容
• 样品制备 • 透射电子显微像 • 选区电子衍射分析
b.将样品放入减薄仪，接通电源；
c.样品穿孔后，光导控制系统会自动切断电源， 并发出警报。此时应关闭电源，马上冲洗样品， 减小腐蚀和污染。
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透射电子显微镜样品制备
双喷电解减薄法
缺点： 只适用于金属导体，对于不导电的样品无 能为力。

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离子减薄装置原理示意图
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终减薄方法
双喷式电解抛光减薄
离子减薄
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常见终减薄方法
（1）电解抛光法
选择合适的电解液及相应的抛 光制度均匀薄化晶体片，然后在晶 体片穿孔周围获得薄膜。这个方法 是薄化金属的常用方法。
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（2） 喷射电解抛光
将电解液利用机械喷射方法喷 到试样上将其薄化成薄膜。这种方 法所获得的薄膜与大块样品组织、 结构相同，但设备较为复杂。
• 纤维类样品得直径应最好小于200纳米。 • 不论是纤维，粉末或高分子纳米球的样品都要
在适当的溶液中做良好的分散，然后滴在或捞 到铜网上的支撑膜上。
• 对于特殊样品需要做特殊的制备，列如：切片， 染色，离子减薄或复型处理。
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铜网和承载样品的支撑膜
• 透射电子显微镜使用的铜网一般直径为2毫 米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网 上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸 镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品 就承载在这种支撑膜上。
• 如果在连续的火棉胶膜上再制出一些通透 的孔，我们把这种支撑膜叫作“微筛”。 高分辨分析时一般使用微筛来承载样品。
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什么是染色？
• 对于反射电子能力差，图像衬度小的样品常用染 色的方法来提高成像的质量。染色的目的就是让 被分析样品结合上一些重金属，以增加其反射电 子的能力，使样品成像的衬度变大，最终获得高 质量的电镜照片。
是加强支持膜。
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支持膜法 粉末试样和胶凝物质水化浆体多采用此法。
一般做法是将试样载在一层支持膜上或包在薄 膜中，该薄膜再用铜网承载。
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支持膜法
• 支持膜材料必须具备的条件： ① 无结构，对电子束的吸收不大； ② 颗粒度小，以提高样品分辨率； ③ 有一定的力学强度和刚度，能承受电子束的