雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达

雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达作者：郑纯威陈宇丰奕波黄强来源：《中国现代医生》2013年第34期[摘要] 目的研究雄激素受体（AR）敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管中表达的改变。

方法采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配，并敲除胚胎中AR，筛选AR敲除（AR敲除组）和AR未敲除（对照组）雄性小鼠各10只，对比睾丸曲细精管生精功能及p63的表达。

结果两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P < 0.05），p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞，精子细胞及成熟精子中表达呈阴性，且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P < 0.01）。

结论 AR表达与小鼠睾丸曲细精管p63表达关系密切，AR 敲除小鼠睾丸曲细精管生精功能受损、p63表达下调，p63调控生殖细胞的早期分化。

[关键词] 雄激素受体；基因；p63；生精功能[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）34-0001-03The testicular spermatogenic function and expression of p63 in androgen receptor knockout mouseZHENG Chunwei CHEN Yu FENG Yibo HUANG QiangLaboratory Animal Center of Zhejiang Province Traditional Chinese Medicine Academy，Hangzhou 310007， China[Abstract] Objective To study spermatogenesis and p63 expression in the seminiferous tubules of the testicular androgen receptor （AR） knockout mice. Methods Male Flox-AR mice mated with female ACTB-Cre mice， and knocked the AR in addition to embryos， screening AR knockout male mice （ARKO group） and AR did not knock （control group），each of 10 mice. Contrasted testis seminiferous tube spermatogenic function and p63 expression. Results The differences of seminiferous tube diameter， the peritubular film thickness， wall germ cell layers， the germ cell maturity score and Makler score between two groups were statistically significant （P < 0.05）， p63 mainly expressed in spermatogonia and spermatocytes， expressed in sperm cells and mature sperm were negative， and AR knockout group expression the positive rate and HSCRE of scores were significantly lower than the control group （P < 0.01）. Conclusion AR expression in mouse testis seminiferous tubules are closely related p63 expression. AR knock damage in addition to the mouse testis seminiferous tube spermatogenic function of p63 downregulation of p63 regulation of the early differentiation of the germ cells.[Key words] Androgen receptor； Gene； p63； Spermatogenic function雄激素主要由睾丸间质细胞分泌，诱导男性性别的分化，促进内生殖器发育，进入曲细精管促进生精细胞的分化和精子生成[1]。

雄激素受体（androgen receptor，AR）主要分布于睾丸内支持细胞、间质细胞、管周细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等组织，与雄激素结合调节靶基因表达，介导雄激素发挥一系列的生物学作用，对性别分化、男性性成熟及精子生成有重要作用，AR突变导致与雄激素结合力或受体转录后的活性发生改变，从而影响男性生育能力[2]。

有研究表明，AR缺陷的小鼠可能出现睾丸显著缩小，前列腺、附睾、精囊等组织的缺如，血清睾酮水平降低[3]。

其作用的途径和方式的研究对了解男性生殖系统发育有十分重要的意义。

p63与抑癌基因p53同源，在不同的组织和不同发育阶段具有不同的生物学功能。

p63在胚胎的外胚层和表皮组织基底层和生发层中显著表达，通过其编码的活性产物调节胚胎形成期外胚层的分化，在哺乳动物胚胎发育阶段，调控各种上皮组织的正常发生和分化，并维持细胞的形态，是胚胎发育过程中上皮分层所必需的蛋白质[4，5]。

p63缺陷小鼠皮肤及泌尿生殖道上皮出现发育不全[6]。

本研究于2012年1～12月进行AR敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管的表达研究，旨在探讨AR敲除对小鼠生殖功能及睾丸发育的影响。

1 材料与方法1.1 材料雄性Flox-AR小鼠，由美国罗切斯特大学医学中心张传祥教授实验室提供[6]；雌性ACTB-Cre小鼠，由美国JAX实验室提供。

小鼠抗人p63单克隆抗体、S-P试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法按Flox-AR小鼠与ACTB-Cre小鼠交配。

采用Cre-lox法[7]敲除胚胎中小鼠AR。

取子代小鼠尾巴组织标本，通过PCR检测基因型，选择AR敲除的雄性小鼠10只作为AR敲除组，AR未敲除雄性小鼠10只作为对照组。

至10周龄称重后以5%CO处死，均取右侧睾丸，4%中性甲醛液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切4 μm薄片，脱蜡，水化，采用p63鼠单克隆抗体以S-P免疫组织化学染色法进行组织p63染色，操作均按试剂盒说明进行。

DAB显色，冲洗，苏木精复染，以PBS代替一抗作阴性对照。

置于高倍光学显微镜下观察，p63主要定位于细胞核，细胞核呈棕黄色则为p63阳性。

随机选取视野内10个睾丸曲细精管断面，观察p63表达，测定曲细精管内径、管壁生殖细胞层数目、管周膜厚度、生殖细胞成熟度。

1.3 判断标准睾丸生精功能采用Makler评分法[8]测定，曲细精管内径、管壁生殖细胞层数目、管周膜厚度、生殖细胞成熟度，每项分为0～5分，满分20分，得分越高功能越正常。

p63表达强度采用半定量的免疫组织化学积分法（HSCORE）[5]，公式：HSCORE=∑Pi（i+1）。

染色强度的主观评估（i）由无染色至强染色分为0～3分，Pi为每个细胞中的强度百分比。

1.4 统计学处理数据采用SPSS17.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，相关性采用Spearman等级相关分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 两组睾丸生精功能比较两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P < 0.05），AR敲除组睾丸生精功能显著低于对照组，见表1。

表1 两组睾丸生精功能及p63表达的比较（x±s）2.2 p63在小鼠睾丸曲细精管中的表达p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞，精子细胞及成熟精子中表达呈阴性，且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P < 0.01），见表1；AR敲除组p63表达强度显著低于对照组，见图1、2。

经Spearman等级相关分析，p63的表达强度与Makler 评分呈正相关（r=0.88，P < 0.01）。

3 讨论AR存在于睾丸的支持细胞、间质细胞、管周细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞内介导睾丸结构及功能的发育，而支持细胞、间质细胞、管周细胞等的发育依赖雄激素及AR的表达，AR表达缺陷则可能造成睾丸各组织结构发育不全。

本研究采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配，从而使子代雄性小鼠所有细胞表达Cre，并能通过Cre-lox法敲除胚胎中的AR，建立AR敲除的小鼠模型，经PCR检测基因型确认模型成功建立。

取AR敲除组小鼠睾丸组织样本镜检结果显示，小鼠的曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度与未敲除AR的对照组相比，存在显著差异。

AR表达缺陷的小鼠曲细精管内径变细，管周膜厚度增加，管壁生殖细胞层数减少，生殖细胞成熟度低。

通过Makler评分法评估，其睾丸生精功能显著低于对照组，由于AR的表达在生精周期第Ⅱ～Ⅶ期表达逐渐增强，第Ⅷ期后减弱，而在Ⅺ期出现特异性表达，表明其表达强弱与生精周期密切相关，参与精子生成的调控[9，10]，因此AR缺陷使小鼠曲细精管及生精细胞的结构及功能发育出现显著异常，生精周期出现功能紊乱影响雄性小鼠的精子生成。

p63缺失的小鼠可能出现头颈部表皮和肢端的发育畸形，前列腺、乳腺及尿道上皮的发育缺陷[11，12]。

本研究对小鼠曲细精管中的p63表达进行分析，在小鼠曲细精管组织中p63表达主要位于精原细胞及精母细胞细胞核，呈棕黄色颗粒，AR表达正常的对照组小鼠曲细精管组织中p63表达强度很高，p63阳性细胞为（82.73±5.44）%，而AR敲除组p63阳性率仅为（67.38±2.93）%，半定量的HSCORE评分亦显示AR敲除组表达强度显著低于对照组，说明在胚胎期敲除AR导致小鼠生殖系统上皮及腺体内p63的表达降低。

并且p63的表达与Makler 评分呈正相关，说明p63低表达与曲细精管的生精能力下降有关。