乳腺癌MCF7细胞株中肿瘤干细胞鉴定模式的建立
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PDZ结合激酶T-LAK细胞来源的蛋白激酶在恶性肿瘤中的作用机制研究进展
《癌症进展》2021年3月第19卷第5期ONCOLOGY PROGRESS,Mar2021V ol.19,No.5*综述*PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶在恶性肿瘤中的作用机制研究进展△宋开蓉1,2，刘媛1,2，陈思璐1,2，杨永秀2,3#1兰州大学第一临床医学院，兰州7300002甘肃省妇科肿瘤重点实验室，兰州7300003兰州大学第一医院妇产科，兰州730000摘要摘要：：PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶（PBK/TOPK）属于促分裂原活化的蛋白激酶（MAPKK）家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在人类的多种正常组织中不表达或呈低表达，而在癌变后的组织细胞中呈高表达，通过激活多条细胞内信号转导通路，促进多种细胞因子的分泌，引起机体内一系列转录因子和肿瘤基因等的表达量发生变化，参与调节细胞的增殖，促进恶性肿瘤细胞的侵袭、迁移，甚至抵抗凋亡等，为恶性肿瘤的治疗提供了新靶点。
本文综述了PBK/TOPK在不同恶性肿瘤中的作用机制及其抑制剂作为抗肿瘤药物的研究进展。
关键词关键词：：PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶；恶性肿瘤；抑制剂；抗肿瘤药物中图分类号中图分类号：：R730文献标志码文献标志码：：A doi：10.11877/j.issn.1672-1535.2021.19.05.051PBK/TOPK的发现Gaudet等[1]首次通过酵母双杂交技术筛选鉴定出一种可与果蝇肿瘤抑制蛋白DLG的人类同源物（the human homologue of the Drosophila Discs-large tumor suppressor protein，hDlg）分子PDZ结构域相结合的新型蛋白激酶，命名为PDZ结合激酶（PDZ binding kinase，PBK）。
经测序发现，其与Abe等[2]克隆并命名的淋巴细胞激活的杀伤T细胞源性蛋白激酶（T-LAK cell-originated protein ki-nase，TOPK）属于同一分子，故统称为PBK/ TOPK。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定
人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定乳腺癌是广泛存在于女性中的一种恶性肿瘤，其发病率一直处于不断增加的趋势，严重威胁着女性的健康和生命。
干细胞作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞种群，已经成为近年来研究乳腺癌的热门话题之一。
在这其中，人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定成为当前研究的重点之一。
干细胞在分离过程中往往需要特定的培养基和培养条件，以确保其生命力和多向分化的潜能。
乳腺组织干细胞也不例外。
目前，最常用的乳腺组织干细胞分离方法有胶原酶消化法、互斥聚集法、磁珠贴附法以及细胞表面标记法等。
胶原酶消化法是一种常用的乳腺组织干细胞分离方法。
该方法通过将新鲜乳腺组织切成小块，利用胶原酶等酶类消化来获得细胞，经过培养后，即可分离出干细胞。
互斥聚集法则是通过利用乳腺组织中细胞膜不同微环境的特性，将不同细胞类型进行分离。
而磁珠贴附法和表面标记法，则是通过表面标记技术来抑制非干细胞或其他非目标细胞，显著提高干细胞的纯化度。
在乳腺癌的研究中，乳腺干细胞的鉴定尤其重要。
目前，鉴定干细胞的常用指标有干细胞特异性标志物、自我更新和多向分化的能力、单克隆球体形成能力以及移植性等。
干细胞特异性标志物是指一些特定的蛋白质或表面细胞分子，能够标记出干细胞群体。
CD44、CD49f、CD24等是常用于鉴定乳腺干细胞的特异性标志物。
在干细胞的自我更新能力方面，Ballios等人发现，使用方便且重复性好的颠倒培养法可以对干细胞的自我更新能力进行大量快速的筛选，为干细胞的高通量筛选提供了有效的途径。
单克隆球体形成能力和移植性则是干细胞的另外两个鉴定重点。
单克隆球体指一种只有干细胞才能形成的球状细胞团，能够自我更新和分化成多种细胞类型。
而移植性则是通过移植干细胞至动物体内，观察其能否够参与到新的组织器官的生成中。
总之，对人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定的研究，为乳腺癌的治疗和预防提供了新的思路和方法。
未来，我们还需要进一步完善干细胞分离鉴定的技术，以更好的了解干细胞在乳腺癌发生和发展中的作用，为临床治疗提供更加有效和可行的方案。
实验肿瘤药理学—抗肿瘤药物的药效学评价
3
3. 样品抗肿瘤活性的确证（二） ——体外筛选实验
3.1原理与基本操作要点 3.1.1实验原理 3.1.2基本操作要点 3.2常用的肿瘤细胞株介 绍 3.3抗肿瘤药物体外筛选 的实验设计
3.4常用的评价方法 3.4.1细胞拒染法 3.4.2生长曲线法 3.4.3克隆计数法 3.4.4MTT法 3.4.5SRB法 3.5其它评价方法
17
2.1概述
实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同，可以分为自发性肿瘤、 诱发性肿瘤以及移植性肿瘤。
小鼠常见高自发性肿瘤举例
动物品系 C3H DBA/1 A AKR PBA C57BL … 肿瘤组织类型 乳腺癌 乳腺癌 肺瘤（癌） 淋巴细胞性白血病 淋巴瘤 网织细胞肉瘤 … 发生率 99% 75% 90% 91% 100% 74.5% … 月龄 7.2 >12 >18 10 8.7 14 …
5532常用肿瘤细胞株概要细胞株名称生物学特点研究应用mel红白血病细胞hl60白血病细胞k562白血病细胞wehi3b白血病细胞b16黑色素瘤细胞a2780卵巢癌细胞mcf7乳腺癌细胞kb口腔癌细胞a549肺癌细胞ht1080纤维肉瘤细胞3t3l1成纤维细胞nb4白血病细胞dba2小鼠白血病人白血病人balbc小鼠c57bl6小鼠卵巢癌病人乳腺癌病人口腔癌病人肺癌病人纤维肉瘤病人3t3小鼠白血病人悬浮培养小细胞球状基本为二倍体有染色体异常细胞较大酸性磷酸酶阳性基本为三倍体ph染色体阳性培养条件不适可影响分化诱导的敏感性密度高过会自分化高低密度时细胞形态有变化可移植到动物体内对阿霉素及苯丙氨酸氮芥敏感上皮样生长单层上皮样生长上皮样生长上皮样生长倍增时间较长26小时非典型的肿瘤细胞达到饱和浓度时有接触性抑制具有人早幼粒细胞白血病所特有的典型的染色体异常分化诱导实验分化诱导实验分化诱导实验耐药分化诱导实验分化诱导或细胞杀伤实验细胞杀伤及耐药实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤及抗侵袭实验分化诱导或细胞杀伤实验分化诱导实验5633样品初筛时应该注意三点
陈皮多甲氧基黄酮类成分对人乳腺癌MCF-7、肝癌HepG2细胞株增殖抑制作用及其敏感性比较
敏感性。
关 键 词 陈 皮 多 甲氧 基 黄 酮 人 肝 癌 细 胞 株 中 图分 类 号 Ｒ７ ７９ ３． 文 献标 识 码 Ａ
人 乳腺 癌 细胞 株
体 外 实验
文章 编 号 １ ７ — ９ Ｘ（ ０ ７ １ — ０ ９ ０ ６２ ３ ７ ２ ０ ）１ ０ ７ — ２
陈 皮 为 芸 香 科 植 物 橘 （ ｉｕ Ｃｔ ｓ ｒ ｒｔ ｕａ １ｎ ｏ 及 其 栽 培 变 种 的 干 燥 ｅｉ ｌｔ Ｂ ａ ｃ ） ｃ ａ
设 ６个 复 孔 ．置 于 ３ ℃ Ｃ ， 养 箱 中 ７ Ｏ培 分别 培 养 ２ 、８ ７ ｈ 于 培 养 终 止 前 ４ ４４ 、２ ， ｈ 各 孔 分 别 加 入 １ ％的 ＭＴ ＂ 液 １ ， ． ０ Ｉ溶 ０ｌ ４ ｈ后 弃 上 清 ． 每 孔 加 入 二 甲 基 亚 砜 １０ １ ５ ￣ ．置 振 荡 器 充 分 混 匀 ．继 续 培 养 １ ．于酶 标 仪 ４ ０ ｍ 处 ．检 测 各 孔 Ｏ ｈ ９ｎ Ｄ
提
要 目的 ： 究 陈皮 多 甲氧 基 黄 酮 类 成 分 （ Ｍ） 人 乳 腺 癌 、 癌 细 胞 株 的 增 殖抑 制 作 用 并 对 其 敏 感 性 进 行 比 研 Ｃ 对 肝
较 方 法 ： 用 Ｍ１ １ 观 察 Ｃ 对 人 乳 腺 癌 ＭＣ 一 、 癌 Ｈ ｐ ２细 胞 株 的增 殖抑 制 作 用 。 结 果 ： 同 剂 量 Ｃ １ ｍｇ 、 采 Ｔ法 Ｉ Ｍ Ｆ ７肝 ｅＧ 不 Ｍ（ Ｏ ／ Ｌ ２ ｍ ／ ４ ｍ ／ ） 用 于 ＭＣ 一 ０ ｇ Ｌ、０ ｇ 作 Ｌ Ｆ ７细 胞株 ，４ ２ ｈ细 胞 抑 制 率 分 别 为 １ ．５ 、９７ ％ 、４３ ％ ，８ ８７ ％ １ ．９ ３ ．８ ４ ｈ细 胞 抑 制 率 分 别 为 １ ． ％、 ７ ９ ３
关 键 词 陈 皮 多 甲氧 基 黄 酮 人 肝 癌 细 胞 株 中 图分 类 号 Ｒ７ ７９ ３． 文 献标 识 码 Ａ
人 乳腺 癌 细胞 株
体 外 实验
文章 编 号 １ ７ — ９ Ｘ（ ０ ７ １ — ０ ９ ０ ６２ ３ ７ ２ ０ ）１ ０ ７ — ２
陈 皮 为 芸 香 科 植 物 橘 （ ｉｕ Ｃｔ ｓ ｒ ｒｔ ｕａ １ｎ ｏ 及 其 栽 培 变 种 的 干 燥 ｅｉ ｌｔ Ｂ ａ ｃ ） ｃ ａ
设 ６个 复 孔 ．置 于 ３ ℃ Ｃ ， 养 箱 中 ７ Ｏ培 分别 培 养 ２ 、８ ７ ｈ 于 培 养 终 止 前 ４ ４４ 、２ ， ｈ 各 孔 分 别 加 入 １ ％的 ＭＴ ＂ 液 １ ， ． ０ Ｉ溶 ０ｌ ４ ｈ后 弃 上 清 ． 每 孔 加 入 二 甲 基 亚 砜 １０ １ ５ ￣ ．置 振 荡 器 充 分 混 匀 ．继 续 培 养 １ ．于酶 标 仪 ４ ０ ｍ 处 ．检 测 各 孔 Ｏ ｈ ９ｎ Ｄ
提
要 目的 ： 究 陈皮 多 甲氧 基 黄 酮 类 成 分 （ Ｍ） 人 乳 腺 癌 、 癌 细 胞 株 的 增 殖抑 制 作 用 并 对 其 敏 感 性 进 行 比 研 Ｃ 对 肝
较 方 法 ： 用 Ｍ１ １ 观 察 Ｃ 对 人 乳 腺 癌 ＭＣ 一 、 癌 Ｈ ｐ ２细 胞 株 的增 殖抑 制 作 用 。 结 果 ： 同 剂 量 Ｃ １ ｍｇ 、 采 Ｔ法 Ｉ Ｍ Ｆ ７肝 ｅＧ 不 Ｍ（ Ｏ ／ Ｌ ２ ｍ ／ ４ ｍ ／ ） 用 于 ＭＣ 一 ０ ｇ Ｌ、０ ｇ 作 Ｌ Ｆ ７细 胞株 ，４ ２ ｈ细 胞 抑 制 率 分 别 为 １ ．５ 、９７ ％ 、４３ ％ ，８ ８７ ％ １ ．９ ３ ．８ ４ ｈ细 胞 抑 制 率 分 别 为 １ ． ％、 ７ ９ ３
细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍
一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。
在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。
在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。
人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。
细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。
当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。
细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。
图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。
然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展翁泽安【摘要】Aurora-A(极光激酶A)是一种高度进化保守蛋白激酶,在肿瘤细胞形成过程中发挥重要的调控作用.人体多种实体肿瘤均发现Aurora-A的过表达,高表达的Aurora-A通过多种分子机制参与肿瘤的生存、增殖,而且Auro-ra-A的表达水平与肿瘤患者的药物抵抗和不良预后呈正相关.本文介绍了Aurora-A的结构和亚细胞定位、活化和降解的具体途径,本文着重阐述Aurora-A促进肿瘤形成的分子机制,从而为肿瘤的药物治疗提供新的治疗靶点.【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》【年(卷),期】2017(034)004【总页数】5页(P65-68,71)【关键词】Aurora-A;蛋白激酶;肿瘤形成【作者】翁泽安【作者单位】三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院湖北宜昌443000【正文语种】中文【中图分类】R737.33极光激酶A(Aurora-A)是高度进化保守的丝/ 苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，在细胞有丝分裂和肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。
Aurora激酶是在研究果蝇过程中首次被发现[1]，目前研究证实，在哺乳动物的细胞中，至少存在Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C三种Aurora激酶[2]。
前期研究证实，Aurora-A在细胞有丝分裂过程中发挥关键的作用。
Aurora-A主要调控中心体和微管的功能，主要涉及中心体的复制和分离，纺锤体的组装，染色质的凝聚，G2-M期的转换以及细胞质的分裂[3]。
下调Aurora-A的表达可导致纺锤体组装和染色体分离的障碍，最终导致基因的不稳定和肿瘤形成[4]。
在机体多种肿瘤中均发现Aurora-A的过表达，如乳腺癌，胃癌，卵巢癌，食管癌，结肠直肠癌等，这暗示Aurora-A可能在肿瘤形成中发挥重要作用。
Aurora-A的过表达可能和肿瘤患者的不良预后有关，因此有可能成为新的治疗靶点[5]。
本文从Aurora-A的结构和亚细胞定位，Aurora-A活化和降解的调节等方面就Aurora-A在肿瘤细胞的表达和促进肿瘤形成的途径进行综述。
高中生物专题2细胞工程单元素养评价(含解析)新人教版选修3
单元素养评价(二)(专题2)(60分钟100分)一、选择题(共8小题,每小题2分,共16分)1.(2019·北京高考)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。
研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株,再将二者杂交后得到F1,结合单倍体育种技术,培育出同时抗甲、乙的植物新品种。
以下对相关操作及结果的叙述,错误的是( )A.将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞B.通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定C.调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株D.经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体【解析】选D。
本题考查基因工程的操作步骤以及单倍体育种方法。
导入受体细胞的基因表达载体应含有目的基因和标记基因等,A项正确;对转基因植株可以用接种病原体的方法进行个体水平鉴定,B项正确;脱分化和再分化过程所用生长素和细胞分裂素的浓度比例不同,C项正确;经过花粉离体培养获得的幼苗是单倍体,需要经过秋水仙素诱导处理,使染色体数加倍,才能获得二倍体,D项错误。
2.如图所示为人类“治疗性克隆”的大概过程。
下列说法中,不正确的一项是 ( )A.过程A表示细胞核移植,是目前实现体细胞克隆的关键技术B.经过程B得到的结构中,④是未分化的细胞,因而这些细胞被认为是胚胎干细胞C.相同的胚胎干细胞,“克隆”的结果各种各样,这为揭示细胞凋亡和细胞分化机理提供了有效手段D.一小男孩患有白血病,不能利用造血干细胞(设计试管婴儿)来进行有效治疗【解析】选D。
过程A表示细胞核移植,是目前实现体细胞克隆的关键技术。
④是未分化的细胞,因而这些细胞被认为是胚胎干细胞。
相同的胚胎干细胞经过“克隆”会形成各种细胞,这就为揭示细胞凋亡和细胞分化机理提供了有效手段。
若一小男孩患有白血病,可利用其出生时保留的脐带血进行治疗,如果没有保留脐带血,则可利用造血干细胞(设计试管婴儿)来进行有效治疗。
3.下列育种过程不能体现细胞或细胞核全能性的是( )A.将悬铃木无菌苗叶片细胞制成原生质体,培养得到再生植株B.将甲流病毒外壳蛋白诱导的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合,培养获得抗甲流抗体C.将大熊猫的细胞核植入去核的兔子卵母细胞中,培养出大熊猫早期胚胎D.将中华猕猴桃叶肉细胞与狗枣猕猴桃叶肉细胞融合,获得耐寒性提高的新品种【解析】选B。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
海肾荧光素酶近红外萤火虫荧光素酶腔肠荧光素等一系列荧光活体成像试剂用于肿瘤光热治疗
海肾荧光素酶近红外萤火虫荧光素酶腔肠荧光素等一系列荧光活体成像试剂用于肿瘤光热治疗活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。
这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率的首位。
乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。
萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.一．细胞方法将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。
通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.G418筛选浓度的确定：37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。
在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部死亡。
每天观察细胞生长情况，死亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。
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干细胞鉴定模式 ， 该模式适用于体外培养 的肿瘤细胞株 中肿瘤干细胞的鉴定。
肿瘤 干 细胞是 指 肿瘤 细胞 中具有 自我 更新 和多
重 悬并 计 数 。 在 玻 璃 培 养 皿 中预 先 加 入 深 约 ０ ３ ．
ｃ 的完 全培 养基 （ ２ ％ 胎 牛血 清 ） 置 于 ３ ｍ 含 ０ 并 ７℃
验， 观察符合 成瘤性克隆纳入标准的单细胞克隆的成瘤性 。结果 成瘤 性克 隆的纳入标 准 ： 单细胞 种植后 １周 即 形成细胞数 ＞５ 的克 隆 ， ０个 细胞大小形态正常 ， 大部分 细胞 状态 良好 ； ２周时 克隆迅速 扩增至 ＞ ０ 第 ３ ０个 ， 至达 甚 １００ 以上 ， ０ 个 细胞状态好 ， 克隆 中心可有（ 或无 ） 少量细胞 凋亡。符合上述 标准 的单 细胞克 隆可 以 １０ ０ ％扩增 成功 并连续移植成瘤 ， 而相应排除的克隆成瘤率 ＜１％ 。结论 ０
摘要 ： 目的 探讨 适用于体外培养的乳腺癌 ＭＣ ７细胞 中肿 瘤干细胞 的鉴定模 式。方法 取人乳腺 癌 Ｍ Ｆ Ｆ Ｃ７ 细胞株 ， 在显微操作法的基础上改进单细胞分离种植技术 ， 用该技术分离 ＭＣ ７单细胞 并种植 到 ９ 孔板 ， Ｆ ６ 观察单细 胞克隆生长情况并依据其生长特征制订成瘤 性克 隆的纳入标 准。随机扩增 ＭＣ ７单 细胞克 隆并进行 移植成 瘤实 Ｆ
分类 。＠ＭＣ ７单 细胞 克 隆扩 增及 移 植成 瘤 ： Ｆ 随机 扩
１１ 材料 ．
人 乳 腺 癌 ＭＣ ７细 胞 系 购 自中科 院上 Ｆ
海 细胞 库 ， 实验 用 的 ＭＣ ７细 胞 株 为 ＭＣ ７单 细 胞 Ｆ Ｆ 来 源 的亚 株 。Ｒ ＭＩ６０培 养 基 及 Ｆ Ｓ Ｐ １４ Ｂ 。裸 鼠。单 细 胞分 离种植 装 置为 自行研 制 。
月 ， 们 在研 究 中建 立 了单 细 胞分 离 种 植一 成瘤 性 我 克 隆 的 肿 瘤 干 细 胞 鉴 定模 式 ， 在 人 乳 腺 癌 ＭＣ ７ 并 Ｆ 细胞 株进 行 了验证 。现将结 果 报告 如下 。
１ 材 料 与方 法
无菌 ９ ６孔板 内加好 适应 培养 基 ） 。
１２３ Ｍ Ｆ 单细胞克隆成瘤性实验 ＠Ｍ Ｆ ．． Ｃ ７ Ｃ ７单 细胞克 隆 ： 述 ＭＣ ７单 细 胞 种 板 后 培 养 １周 和 ２ 上 Ｆ 周时分 别记 录克 隆 的细 胞 数 ， 察 细 胞形 态 及 其 生 观 长状态 ， 据 克 隆 的细 胞 数 目及 生 长特 点 制 订 成瘤 根 性克隆的纳入标准 ， 照纳入标准 将单 细胞克 隆进行 按
关 键 词 ： 瘤 干 细 胞 ； 隆细 胞 ； 瘤 细 胞 ； 腺 癌 肿 克 肿 乳
中 图分 类 号 ：７ ７ ９ Ｒ ３ ． 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ （０ ０ ２ － ２ － １０ －６ Ｘ ２ １ ）６０ ５０ ． ０ ２
建立 了乳腺癌 ＭＣ ７单细胞 分离种植一成瘤 性克隆 的 Ｆ
后即 ＞ ０ ３０个 ， 甚至达 １ ０ ０个 以上 ， ０ 细胞状 态较好 ， 背 景浅且 均一 ， 少 数 克 隆 中心 出现 少量 细 胞凋 亡 仅
现象。
点 。与体 内移植成瘤模式相 比， 体外培 养模 式周期更
短、 条件稳定、 不受免疫因素影响。但体外培养模式 对 于肿瘤 干细胞成瘤性 的观察 相对 有限 ， 只适合 并且 特定类型 的肿瘤干细胞 的鉴定 ， 液肿瘤 的肿瘤干 如血 细胞及适应 了体 外培 养 的肿瘤细胞 株 等 。本 研究 在
式同样适用 于其 他肿 瘤细胞 中干细胞 的鉴定 。
参考文 献 ：
［ ］Ｃａ ｅＭＦ ｉ Ｅ，ＤｒｓＰ ，ｔａ． ａｃｒｓ ｍ ｃｌ——ｐ １ ｌｋ 。Ｄｃ Ｊ ｒ ｋ ｉ Ｂ ｅ １ Ｃ ｎｅ ｔ ｅ８ ｋ ｅ ｌ
ｓ ｅ ｔ ｃ ｎ ｃ ｒｅ ｔ ｓ ｔ ｓ ａ ｄ ｆ ｔ ｒ ｉ ｃ ｉｎ ：ＡＡＣＲ ｏ ｋ ｈ ｐ ｐ ｃｉ ｓｏ ｕ ｒ ｎ ｔ ｕ ｎ ｕ ｕ ｅ ｄ ｒ ｔ ｓ ｖ ７单 细 胞 克 隆 的分类 以 生长 特 点 为 依 ． Ｆ 据 ， Ｍ Ｆ 单细 胞 克 隆分 成 两 类 。第 一类 克 隆 符 将 Ｃ＇ ／
合以下条件 ： ①单细胞种植后 １ 周即形成细胞数 ＞ ５ 的克 隆 ， Ｏ个 细胞 大小 、 态 正 常 ， 形 大部 分 细胞状 态 良好。②第 ２ 周克隆迅速扩增达 ３０— ０ 个 ， ０ １ ０ 细 ０ 胞状态好 ， 克隆中心可有（ 或无 ） 少量细胞凋亡。其
１２４ 统计 学方 法 ．．
义。
采 用 Ｓ Ｓ １． Ｐ Ｓ３０统计 软件 。计
数资 料 比较 用 检验 。Ｐ≤００ 为 差异 有统 计 学 意 ．５
２ 结果
２ １ ＭＣ ７单细 胞克 隆 的生 长情 况 ． Ｆ
ＭＣ ７单 细 胞 Ｆ
２５
种植 后 ２ ， 分细 胞开 始逐 渐凋 亡 、 死 、 ４ｈ 部 坏 分解 、 消
山东 医药 ２ １ ００年第 ５ 第 ２ ０卷 ６期
失， 少数细胞在分裂数次之后逐渐凋亡， 另一部分细 胞则 出现第 １ 分 裂 ， 次 出现 分 裂 的细胞 多 数 在种植 后１ 周形成克隆（ 细胞数 ＞ ０个） ５ 。单细胞克隆的 生长 速度 、 细胞状 态存在 较大异质 性 ， 中部分单 细 其 胞克 隆生长缓 慢或状 态不好 ， 内颗粒多 ， 胞 凋亡或坏 死 的细胞 较 多 。但 多 数单 细 胞 克 隆 生长 迅 速 ， ２周
ｌ ０ 个细胞二次移 植 ， 以观察其持 续成瘤 能力 。
液 时过 滤 收集 的培养 基 ） ｌ １比例配制 。 按 ： １２ ２ ＭＣ ７单 细胞分 离种 植 培养 的 ＭＣ ７细胞 ． ． Ｆ Ｆ 按 常规 方法 进行 消化 、 心 、０ 目细 胞 滤筛 过 滤 后 离 ３０
基金 项 目： 西 研 究 生 教 育 创 新 计 划 课 题 基 金 资 助 项 目 广 （ ０ ８０ ９ １０ Ｄ ３ 。 ２０ １５ ８ ０２ ３ ） ＋ 通讯 作者
山东 医药 ２ １ ０ ０年 第 ５ Ｏ卷第 ２ ６期
乳 腺 癌 ＭＣ ７细 胞 株 中肿 瘤 干 细 胞 Ｆ 鉴 定 模 式 的 建 立
黄 名威 陆 云飞 ， ， 沈桂 鑫 李 ， 涛
（ １广 西 医科 大学 ， 宁 ５０ ２ ； 西 医科 大学 第一 附属 医院 ） 南 ３０ １２广
１２ １ 培 养 基 的配 制 常 规 培 养 基 为 Ｒ ＭＩ６０ ．． Ｐ １４ 培 养基 加 １％ Ｆ Ｓ 适应 培 养基 为含 ２ ％ Ｆ Ｓ新 鲜 ０ Ｂ， ０ Ｂ
Ｒ ＭＩ６ ０培养 基 和 陈 旧 的 培 养 基 （ Ｐ １４ 即培 养 细 胞 换
部分 移植 瘤用 Ⅲ型胶 原酶 消化 获取 单 细胞 悬液 后 取
余克 隆归 人第二 类 。
２ ３ ＭＣ ７单 细 胞 克 隆 形 成及 其 成 瘤 结 果 ． Ｆ ４块 ９ Ｌ ６孑 板单 细胞种 植后 获得 的单 细胞 克 隆数 、 类及 分
连续移植成瘤的克隆命名为成瘤性克隆。成瘤性克
隆形成率可反 映细胞株 中肿 瘤干 细胞 的含 量。本研
各类克 隆 随机 扩 增 并 进 行 连 续 移 植 成 瘤 结果 见 表
显微操作法 的基 础上改 进单 细胞分 离种植 技术 并 结
合体内、 外两种鉴定模式的优点 ， 采用单细胞分离种
植一 成瘤性克隆 的模式 鉴 定 Ｍ Ｆ Ｃ ７细胞 中的肿瘤 干 细胞 。由于单细胞种植 时采用 的是适应培养 基 ， 最大 程 度地 避免 了环境 改 变对单 细 胞克 隆形 成 的影 响 。 单 细胞 克 隆形 成 以后 再 进行 扩 增 ， 用细 胞 数量 优 利 势 ， 了成瘤率 ， 而最 大程 度保证 了实验 结果 的 保证 从 可靠性。我们将单 细胞来 源并 可 以扩 增形 成亚 株 和
１ ２ 方 法 ．
增单细胞克隆 ， １ １ 按 ： 消化传代至新 的 ９ 孔板持续 ６
扩增 ， 继而传 至 ２ 板 、 板 和 培养 瓶 （ 持 续 扩 ４孔 ６孔 能 增 到 ６孔板 的克 隆即判断为扩增 成功的克 隆 ） 。将 单
细胞克 隆 来 源 的 细胞 扩 增 至 足 量 的细 胞 数 （ １。 约 ０ 个） 后移植到裸 鼠前肢腋 下 ， 月后观 察成 瘤情 况 。 ２个
向分化 能力 的 干细 胞 样 亚 群 。 目前 ， 瘤 干 细胞 的 肿 鉴定 金标 准 是连 续移 植 成 瘤 实 验 … ， 实 验通 常需 该
要 采用 免疫 缺 陷 鼠为 移植模 型 ， 鉴定 周期 较长 ， 加上
培 养箱 温育 １ ｉ， 滴 管 吸 取 细胞 悬 液 １—２滴 ， ０ｍｎ用 滴 入预 热 的培 养 基 中 ， 次 在 培 养 箱 温 育 １ ｉ。 再 ０ ｍｎ 显微镜 下用单 细胞 分 离 种 植 装 置 随机 挑 取 单 细 胞 ，
逐 孑 种入 ９ 板 （ Ｌ ６孔 ４块 ） 种 板 前 按 ２ ０ ｌ孑 在 中（ ５ ／ Ｌ ，
移植部位的微环境变化及模型 鼠残余 的免疫排斥反 应， 使得 实验 结果 大 受 影 响 口 。理 想 的肿 瘤 干 细胞 Ｊ 鉴定 方 法应 该具 备 量 化 、 特异 性 和敏 感 性 以及 鉴 高 定周 期短 的特点 ¨ 。 为此 ，０ ８年 ９月 一 ００年 ２ ｊ ２０ ２１
和 ， 隆形成率为实际克隆个数除以总孔数 克
３ 讨论
由于缺乏特异 的生物标记 ， 肿瘤干细胞还是通 过 功 能学即成瘤性实验来鉴 定 。Ｋ ｌ ｅｙ等 将来 源 于转 ｌ 基 因小 鼠的淋 巴瘤 和 白血病 细胞移 植 到组织 相容 的
小 鼠体 内， 结果 显 示 ， ０ 的肿 瘤 细胞具 有成 瘤能 ＞１ ％
１ 。表 １ 显示 ， 第一类克隆的扩增成功率和移植成瘤 率 均 为 １０ ， 第 二 类 克 隆 的 扩 增 成 功 率 低 于 该标准综合考 虑 了克 隆的细胞数 量 、 ０％ 而 生长速 度及细胞 １％ ， ０ 两类克 隆 的成 瘤 率 相 比， ０ ０ 。说 明根 据 状态等影响移植成 瘤结 果 的因素 。根据 这 一标 准人 Ｐ＜ ． １ 本研 究提 出的第 一类克 隆 的条 件可 以有 效 区分 成瘤 选的克隆经过 扩增 、 异种移植后 １０ ０％成瘤 ， 除的 而排 性克 隆和非成 瘤性 克隆 。 克 隆成瘤率低 于 １％。有 了成 瘤性克 隆 的纳入标 准 ０ 表１ ＭＣ ７ Ｆ 单细胞克隆及其成瘤结果 后无需对每个单细胞克隆都进行扩 增和移植 验证 ， 节 省 了研 究 时 间和资 源 ， 为后 续 大规 模 的研 究 奠定 基