乳腺癌MCF7细胞株中肿瘤干细胞鉴定模式的建立

《癌症进展》2021年3月第19卷第5期ONCOLOGY PROGRESS,Mar2021V ol.19,No.5*综述*PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶在恶性肿瘤中的作用机制研究进展△宋开蓉1,2，刘媛1,2，陈思璐1,2，杨永秀2,3#1兰州大学第一临床医学院，兰州7300002甘肃省妇科肿瘤重点实验室，兰州7300003兰州大学第一医院妇产科，兰州730000摘要摘要：：PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶（PBK/TOPK）属于促分裂原活化的蛋白激酶（MAPKK）家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在人类的多种正常组织中不表达或呈低表达，而在癌变后的组织细胞中呈高表达，通过激活多条细胞内信号转导通路，促进多种细胞因子的分泌，引起机体内一系列转录因子和肿瘤基因等的表达量发生变化，参与调节细胞的增殖，促进恶性肿瘤细胞的侵袭、迁移，甚至抵抗凋亡等，为恶性肿瘤的治疗提供了新靶点。

本文综述了PBK/TOPK在不同恶性肿瘤中的作用机制及其抑制剂作为抗肿瘤药物的研究进展。

关键词关键词：：PDZ结合激酶/T-LAK细胞来源的蛋白激酶；恶性肿瘤；抑制剂；抗肿瘤药物中图分类号中图分类号：：R730文献标志码文献标志码：：A doi：10.11877/j.issn.1672-1535.2021.19.05.051PBK/TOPK的发现Gaudet等[1]首次通过酵母双杂交技术筛选鉴定出一种可与果蝇肿瘤抑制蛋白DLG的人类同源物（the human homologue of the Drosophila Discs-large tumor suppressor protein，hDlg）分子PDZ结构域相结合的新型蛋白激酶，命名为PDZ结合激酶（PDZ binding kinase，PBK）。

经测序发现，其与Abe等[2]克隆并命名的淋巴细胞激活的杀伤T细胞源性蛋白激酶（T-LAK cell-originated protein ki-nase，TOPK）属于同一分子，故统称为PBK/ TOPK。

肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。

以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。

2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。

3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。

4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。

5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。

6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。

需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。

人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定乳腺癌是广泛存在于女性中的一种恶性肿瘤，其发病率一直处于不断增加的趋势，严重威胁着女性的健康和生命。

干细胞作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞种群，已经成为近年来研究乳腺癌的热门话题之一。

在这其中，人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定成为当前研究的重点之一。

干细胞在分离过程中往往需要特定的培养基和培养条件，以确保其生命力和多向分化的潜能。

乳腺组织干细胞也不例外。

目前，最常用的乳腺组织干细胞分离方法有胶原酶消化法、互斥聚集法、磁珠贴附法以及细胞表面标记法等。

胶原酶消化法是一种常用的乳腺组织干细胞分离方法。

该方法通过将新鲜乳腺组织切成小块，利用胶原酶等酶类消化来获得细胞，经过培养后，即可分离出干细胞。

互斥聚集法则是通过利用乳腺组织中细胞膜不同微环境的特性，将不同细胞类型进行分离。

而磁珠贴附法和表面标记法，则是通过表面标记技术来抑制非干细胞或其他非目标细胞，显著提高干细胞的纯化度。

在乳腺癌的研究中，乳腺干细胞的鉴定尤其重要。

目前，鉴定干细胞的常用指标有干细胞特异性标志物、自我更新和多向分化的能力、单克隆球体形成能力以及移植性等。

干细胞特异性标志物是指一些特定的蛋白质或表面细胞分子，能够标记出干细胞群体。

CD44、CD49f、CD24等是常用于鉴定乳腺干细胞的特异性标志物。

在干细胞的自我更新能力方面，Ballios等人发现，使用方便且重复性好的颠倒培养法可以对干细胞的自我更新能力进行大量快速的筛选，为干细胞的高通量筛选提供了有效的途径。

单克隆球体形成能力和移植性则是干细胞的另外两个鉴定重点。

单克隆球体指一种只有干细胞才能形成的球状细胞团，能够自我更新和分化成多种细胞类型。

而移植性则是通过移植干细胞至动物体内，观察其能否够参与到新的组织器官的生成中。

总之，对人类乳腺组织干细胞的分离和鉴定的研究，为乳腺癌的治疗和预防提供了新的思路和方法。

未来，我们还需要进一步完善干细胞分离鉴定的技术，以更好的了解干细胞在乳腺癌发生和发展中的作用，为临床治疗提供更加有效和可行的方案。

一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。

在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。

在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。

人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。

细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。

当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。

细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。

图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。

然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。

极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展翁泽安【摘要】Aurora-A(极光激酶A)是一种高度进化保守蛋白激酶,在肿瘤细胞形成过程中发挥重要的调控作用.人体多种实体肿瘤均发现Aurora-A的过表达,高表达的Aurora-A通过多种分子机制参与肿瘤的生存、增殖,而且Auro-ra-A的表达水平与肿瘤患者的药物抵抗和不良预后呈正相关.本文介绍了Aurora-A的结构和亚细胞定位、活化和降解的具体途径,本文着重阐述Aurora-A促进肿瘤形成的分子机制,从而为肿瘤的药物治疗提供新的治疗靶点.【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》【年(卷),期】2017(034)004【总页数】5页(P65-68,71)【关键词】Aurora-A;蛋白激酶;肿瘤形成【作者】翁泽安【作者单位】三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院湖北宜昌443000【正文语种】中文【中图分类】R737.33极光激酶A(Aurora-A)是高度进化保守的丝/ 苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，在细胞有丝分裂和肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。

Aurora激酶是在研究果蝇过程中首次被发现[1]，目前研究证实，在哺乳动物的细胞中，至少存在Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C三种Aurora激酶[2]。

前期研究证实，Aurora-A在细胞有丝分裂过程中发挥关键的作用。

Aurora-A主要调控中心体和微管的功能，主要涉及中心体的复制和分离，纺锤体的组装，染色质的凝聚，G2-M期的转换以及细胞质的分裂[3]。

下调Aurora-A的表达可导致纺锤体组装和染色体分离的障碍，最终导致基因的不稳定和肿瘤形成[4]。

在机体多种肿瘤中均发现Aurora-A的过表达，如乳腺癌，胃癌，卵巢癌，食管癌，结肠直肠癌等，这暗示Aurora-A可能在肿瘤形成中发挥重要作用。

Aurora-A的过表达可能和肿瘤患者的不良预后有关，因此有可能成为新的治疗靶点[5]。

本文从Aurora-A的结构和亚细胞定位，Aurora-A活化和降解的调节等方面就Aurora-A在肿瘤细胞的表达和促进肿瘤形成的途径进行综述。

单元素养评价(二)(专题2)(60分钟100分)一、选择题(共8小题,每小题2分,共16分)1.(2019·北京高考)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。

研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株,再将二者杂交后得到F1,结合单倍体育种技术,培育出同时抗甲、乙的植物新品种。

以下对相关操作及结果的叙述,错误的是( )A.将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞B.通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定C.调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株D.经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体【解析】选D。

本题考查基因工程的操作步骤以及单倍体育种方法。

导入受体细胞的基因表达载体应含有目的基因和标记基因等,A项正确;对转基因植株可以用接种病原体的方法进行个体水平鉴定,B项正确;脱分化和再分化过程所用生长素和细胞分裂素的浓度比例不同,C项正确;经过花粉离体培养获得的幼苗是单倍体,需要经过秋水仙素诱导处理,使染色体数加倍,才能获得二倍体,D项错误。

2.如图所示为人类“治疗性克隆”的大概过程。

下列说法中,不正确的一项是 ( )A.过程A表示细胞核移植,是目前实现体细胞克隆的关键技术B.经过程B得到的结构中,④是未分化的细胞,因而这些细胞被认为是胚胎干细胞C.相同的胚胎干细胞,“克隆”的结果各种各样,这为揭示细胞凋亡和细胞分化机理提供了有效手段D.一小男孩患有白血病,不能利用造血干细胞(设计试管婴儿)来进行有效治疗【解析】选D。

过程A表示细胞核移植,是目前实现体细胞克隆的关键技术。

④是未分化的细胞,因而这些细胞被认为是胚胎干细胞。

相同的胚胎干细胞经过“克隆”会形成各种细胞,这就为揭示细胞凋亡和细胞分化机理提供了有效手段。

若一小男孩患有白血病,可利用其出生时保留的脐带血进行治疗,如果没有保留脐带血,则可利用造血干细胞(设计试管婴儿)来进行有效治疗。

3.下列育种过程不能体现细胞或细胞核全能性的是( )A.将悬铃木无菌苗叶片细胞制成原生质体,培养得到再生植株B.将甲流病毒外壳蛋白诱导的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合,培养获得抗甲流抗体C.将大熊猫的细胞核植入去核的兔子卵母细胞中,培养出大熊猫早期胚胎D.将中华猕猴桃叶肉细胞与狗枣猕猴桃叶肉细胞融合,获得耐寒性提高的新品种【解析】选B。

常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。

本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。

一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。

（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。

普通培养基采纳DMEM，含10％的。

贴壁生长后，2～3天即可传代。

【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。

2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。

3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。

【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。

(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。

(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。

(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。

2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。

(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。

(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。

(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。

海肾荧光素酶近红外萤火虫荧光素酶腔肠荧光素等一系列荧光活体成像试剂用于肿瘤光热治疗活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。

这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率的首位。

乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.一．细胞方法将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。

通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.G418筛选浓度的确定：37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。

在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部死亡。

每天观察细胞生长情况，死亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

细胞英文名称MDA-MB-231 细胞中文名人乳腺癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长特征特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。

该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因。

培养基L15: Leibovitz Medium血清10%FBS其它因子无传代方法1:2~1:4传代；每周2~3次。

传代情况C5冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性同工酶染色体58~61，有巨核使用权限A类实物状态可用细胞英文名称MDA-MB-468 细胞中文名人乳腺癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长特征特性该细胞是1977年由Cailleau R等从一位患有转移性乳腺癌的51岁黑人女性的胸腔积液中分离得到的。

虽然供体组织的G6PD等位基因杂合，但此细胞株始终表现为G6PD A表型。

P53基因273位密码子存在G→A突变，从而导致Arg→His替代。

每个细胞上存在1×106个EGF 受体。

培养基L15: Leibovitz Medium血清10%FBS其它因子无传代方法1:2~1:4传代；每周换液2~3次。

传代情况C4冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性细胞英文名称SK-BR-3 [SKBR-3；SKBR3] 细胞中文名人乳腺癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长特征特性这株细胞是1970年由Trempe G和Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。

该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达HER2/c-erb-2基因产物。

培养基RPMI 1640 (w/o Hepes)血清10%FBS其它因子无传代方法1:2传代；每周换液2~3次。

传代情况C5冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性同工酶染色体69~80细胞英文名称MCF7 [MCF-7] 细胞中文名人乳腺癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长特征特性该细胞是从一名69岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。

mcf7分子分型
MCF7是一种乳腺癌细胞系，属于ER阳性乳腺癌。

MCF7细胞系是乳腺癌
细胞系中较为常见的一个，它是雌激素受体阳性（ER+）的细胞系，这意味着它对雌激素具有较高的亲和力和依赖性。

MCF7细胞系的分子分型有多种，常见的包括：
1. Luminal A型：这种类型的乳腺癌细胞通常表达高水平的ER和PR（孕
激素受体），但HER2基因扩增和蛋白表达较低。

这种类型的乳腺癌对激素治疗和内分泌治疗敏感，预后相对较好。

2. Luminal B型：这种类型的乳腺癌细胞也表达高水平的ER和PR，但HER2基因扩增和蛋白表达较高。

这种类型的乳腺癌对激素治疗和内分泌治疗有一定敏感性，但可能对化疗和靶向治疗更敏感。

3. HER2过表达型：这种类型的乳腺癌细胞HER2基因扩增和蛋白表达较高，ER和PR表达较低。

这种类型的乳腺癌对化疗、靶向治疗和曲妥珠单抗治疗敏感，但可能对激素治疗不敏感。

4. 三阴性乳腺癌：这种类型的乳腺癌细胞ER、PR和HER2基因表达均为阴性。

这种类型的乳腺癌对激素治疗、内分泌治疗和靶向治疗不敏感，通常需要采用化疗等治疗方案。

需要注意的是，MCF7细胞系的分子分型并不是绝对的，不同的实验条件和研究结果可能会有所不同。

因此，在实际的实验设计和研究中，需要根据具体情况进行分子分型分析和验证。

2023北京高三二模生物汇编生物技术与工程1．（2023·北京西城·统考二模）激素应用广泛。

下列激素应用不当的是（）A．成年人注射生长激素以促进身高增长B．糖尿病患者定时注射胰岛素以控制血糖C．给供体母牛注射促性腺激素促进超数排卵D．应用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织分化2．（2023·北京西城·统考二模）将来自灰毛鼠某种组织的癌细胞注入白毛鼠早期胚胎中，再将胚胎植入代孕雌鼠体内，生出的大鼠具有灰白条纹（嵌合体）。

相关叙述正确的是（）A．灰白条纹鼠所有体细胞遗传信息相同B．抑癌基因表达水平上调导致细胞癌变C．胚胎发育中癌细胞基因表达发生变化D．嵌合体相互交配后代均为灰白条纹鼠3．（2023·北京西城·统考二模）医生可利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV。

下列叙述错误的是（）A．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物B．血液样品中HIV的RNA经逆转录后进行PCR检测C．可通过抗原-抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原D．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染4．（2023·北京昌平·统考二模）普通六倍体小麦基因组庞大，研究相对困难。

拟南芥基因组测序已完成，遗传背景相对清晰。

用紫外线分别照射普通小麦愈伤组织的原生质体30s、1min、2min，再与拟南芥原生质体进行融合，可将小麦染色体小片段插入拟南芥基因组。

下列叙述错误的是（）A．紫外线照射可随机破坏染色体结构B．可利用灭活病毒促进两种原生质体融合C．需设置单独培养的未融合原生质体作为对照组D．借助拟南芥的遗传背景对小麦基因组进行研究5．（2023·北京昌平·统考二模）癌细胞异常表达某些膜蛋白，影响原有的细胞识别，并借此逃避免疫系统的监视与攻击。

下列叙述错误的是（）A．膜蛋白可参与细胞间的信息交流B．癌细胞只有原癌基因没有抑癌基因C．膜蛋白的合成与加工需要多种细胞器分工协作D．靶向异常膜蛋白的单克隆抗体可用于癌症治疗6．（2023·北京朝阳·统考二模）以下不属于对转基因生物安全性评价的是（）A．对转基因生物的颜色、大小、形态的评价B．对转入基因是否会污染本土生物进行评价A．接种时，将高浓度菌液涂布在平板培养基上15．（2023·北京海淀·统考二模）人源干细胞传代培养时，容易出现凋亡现象。

肿瘤干细胞的分子标志物鉴定随着分子生物学研究技术的不断发展，肿瘤细胞中具有干细胞特性的细胞群体-肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs）受到了越来越多的关注。

CSCs具有自我更新、自我修复、多向分化为多种肿瘤细胞，以及特殊的抗癌药物耐药性等特征，因此对于肿瘤治疗的研究和治疗具有十分重要的意义。

CSCs的研究需要很好的标记和鉴定手段，以便进行针对性的治疗。

目前，已经发现了许多CSCs的分子标记物，其中细胞表面标记物是最常用的鉴定标记。

首先，CD133是一种细胞表面分子，是CSCs的经典标志。

在多种肿瘤中都能够发现CD133阳性CSCs。

但是CD133作为细胞表面标记在某些情况下的特异性仍在争议之中。

因此，现在还有很多其他肿瘤干细胞标志发现和研究。

其次，2016年，中国科学家发现肺癌干细胞的标记物SPC（Surfactant Protein C）：SPC是一种肺泡表面活性物质，它存在于肺泡II型上皮细胞中，并且只出现在有肺癌干细胞产生的肿瘤中。

这项研究为肺癌干细胞的分类和治疗提供了新的思路。

此外，还有CD44、CD24、EpCAM、ALDH1等标记物在不同肿瘤中发挥了重要作用，从而在鉴定CSCs中也得到广泛应用。

比如CD44通常与干性高的肿瘤相关，而在某些肿瘤中，CD44高表达的CSCs具有骨髓干细胞的性质；CD24的表达则与HER2阳性乳腺癌中的CSCs相联系。

除了细胞表面标记物，还有自身标记物也可以用来寻找CSCs。

ALDH1是肿瘤干细胞的法拉第酸脱氢酶1基因的编码物质，是体内某些组织的干性质的标记之一，被发现在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中，因此可以被用来作为这些肿瘤中干细胞的标记。

但是，不同细胞中CSCs的表达情况是不同的，不同细胞甚至同一细胞内不同亚群、不同状态中CSCs的标记物也各有所不同。

在实际研究中选择合适的标记物非常重要。

CSCs的鉴定标记一般是基于其特异性的结构、功能和分子特性。

人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1(210009 江苏南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3)[摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。

方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。

结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。

光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P<0.01）。

与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。

结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。

[关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白[中图分类号] R737.9乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。

多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。

临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为[基金项目]江苏省社会发展科技计划项目（BS），国家自然科学基金资助项目（）第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话：，E-mail：通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话：, E-mail：30-50%[2]。

肿瘤干细胞的研究套路-干细胞的成球实验操作步骤肿瘤干细胞是是一群既具有自我更新能力又具有较强的侵袭迁移的细胞，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。

肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的金标准。

肿瘤干细胞成球实验一般将分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养，但也可以细胞系做。

恶性程度高的细胞系是很容易成球的，但有的细胞系很困难，所以一般建议用肿瘤干细胞培养，细胞容易成球。

一：一般选择多大的培养皿，6孔板？培养皿可以选择6，12，24孔板，也可以选择100 mm培养皿；二：接种密度？10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索？有没参考密度？密度需要自己摸索。

低密度常用于原代肿瘤干细胞的提取，筛选可以非粘附生长的细胞。

高密度用于细胞球的扩增，一般来说5000个/ml以上的细胞量成球比较好。

三：怎么换液？一周加两次完全培养基。

以6孔板为例，每次加入500ul，加入后轻轻摇匀，细胞球生长很缓慢，培养基中的生长因子至少能够支持2周以上。

直接加入肿瘤干细胞无血清完全培养基，不推荐直接添加的细胞生长因子，确实会影响成球质量。

一旦成球后需要消化传代，细胞球传代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。

据说Accutase和Dispase也可以。

消化步骤如下：170μm的细胞筛过滤收集细胞球，TrypLE Express消化。

22%BSA溶液终止消化，PBS清洗细胞2次。

3重悬细胞，计数。

4用超低吸附的细胞培养板培养细胞（6孔板中每孔加入大约1000个细胞）。

5培养大约10-14天，观察细胞成球情况并计算SPF。

成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。

其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。

SFE的计算方法：SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数/ 每孔中原始接种细胞的总数。

肿瘤干细胞的识别和定位技术近年来，肿瘤干细胞作为一种新型细胞类型引起了人们的广泛关注。

肿瘤干细胞具有多潜能差异化的能力，能够不断自我更新，并且在肿瘤形成、生长、转移等过程中发挥着重要作用。

然而，由于肿瘤干细胞数量较少、分离纯化困难、具有多种表型、功能异质性、生物学特性与正常细胞相似等问题，使得其药物治疗和靶向治疗的效果有限。

因此，肿瘤干细胞的识别和定位技术就显得十分重要。

一、肿瘤干细胞的识别指标目前，肿瘤干细胞的特异性标记物还不太清楚，但许多研究表明，肿瘤干细胞具有一些特殊的细胞表面标记物和功能特异蛋白。

例如，胚胎干细胞标记物CD133、CD44、ALDH、Oct4等，在肿瘤干细胞中表达较高，并且这些标记物常常与肿瘤干细胞的增殖、侵袭、转化等生物学特性密切相关。

CD133是一种五跨膜糖蛋白，该蛋白表达量反映了肿瘤干细胞的自我更新能力和分化能力，其表达状态与肿瘤的预后和转移有重要关系。

CD44是肿瘤干细胞的表面分子，特别是与血管内皮细胞分子VCAM1相互作用，可促进肿瘤细胞侵袭和转移。

ALDH是一种有机磷酸酯酶，对于肿瘤干细胞维持其ALDH高表达状态具有至关重要的作用。

Oct4是一种胚胎发育最初的胚芽干细胞标记物，其在肿瘤干细胞中的功能也受到早期研究的广泛关注。

二、肿瘤干细胞的定位技术肿瘤干细胞的识别后，要进一步进行定位才能针对性地进行治疗。

肿瘤干细胞的定位技术目前主要包括体外和体内两种。

1、体外定位技术体外定位技术主要是对肿瘤干细胞进行分离和富集，目前主要有磁珠分离法、流式细胞仪技术和胶体萃取法等。

磁珠分离法是一种能够高效、快速地富集肿瘤干细胞的方法。

磁珠分离法是利用磁铁和磁性珠子对含有特定靶标的细胞进行快速分离的技术。

该技术可以通过调节磁性珠子的大小和表面密度以及对肿瘤干细胞表面标志物的特异性来实现肿瘤干细胞的高效富集。

流式细胞仪技术是将单个细胞通过高速流动注入到一束聚焦的激光中，通过检测每个单个细胞的荧光信号来确定其表面分子和内部标志物的种类和数量。

体外MTT法对灵芝酸抗人乳腺癌细胞株MCF—7作用的评估目的初步探讨灵芝酸对乳腺癌的抗肿瘤作用。

方法用不同浓度（μg/ml）的灵芝酸溶液分别与MCF-7细胞共育24、48、72h后进行形态学观察，同时MTT 法测定灵芝酸的细胞毒作用。

结果在100μg/ml时共育72h后，对MCF-7细胞的生长具有显著抑制作用（P＜0.01）。

在200μg/ml时共育24h后，对MCF-7细胞的生长具有明显抑制作用（P＜0.05），72h后抑制作用更为显著（P＜0.01）。

随药物浓度增加，对MCF-7的作用呈增长趋势，形态学观察，在400μg/ml和800μg/ml对MCF-7细胞以毒杀作用为主。

结论灵芝酸对乳腺癌细胞有明显抗肿瘤作用，且机制复杂。

标签：灵芝酸；乳腺癌细胞；MTT灵芝Ganoderma lucidum （Curtis：Fr.）P. Karst.在真菌分类上属于担子菌门（Basidiomycota），灵芝科（Ganodermataceae），灵芝属（Ganoderma p，karst），在国内有20余种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝及树舌等，多分布于云、贵、冀、吉、浙、闽等省。

现已从灵芝中分离得到多糖类、灵芝酸类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、油脂类、甾醇类、无机离子类、有机锗等十大类化合物。

目前研究较多的是灵芝多糖，具有抗肿瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等生物活性[1]。

灵芝酸是近年来从灵芝中分离得到的一类具有广泛药理活性的物质，是当今灵芝研究的一个热点。

研究表明灵芝酸具有降低胆固醇、护肝排毒、抑制组织胺释放、止痛、镇静、毒杀肿瘤等功能，是灵芝的主要有效成分之一。

本文对灵芝酸抗乳腺癌细胞株MCF-7作用进行实验。

1 资料与方法1.1一般资料DMEM培养基（购自Gibco公司）及培养用胎牛血清（FCS，天津TBD），MTT，0.25%胰酶购自上海公司；青、链合剂、碳酸氢钠，DMSO 溶液，台盼蓝，PBS溶液为本院中心实验室提供。

乳腺癌细胞株整理（二）引言：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，也是世界范围内死亡率最高的癌症之一。

研究乳腺癌细胞株对于深入了解乳腺癌的发生机制、预防和治疗具有重要意义。

在之前的文档《乳腺癌细胞株整理（一）》中，我们介绍了一部分常用的乳腺癌细胞株。

而本文将继续介绍一些其他有代表性的乳腺癌细胞株并对其特点进行概述。

正文：1. 非侵袭性乳腺癌细胞株：- MCF-7细胞株：MCF-7细胞株是一种常用的非侵袭性乳腺癌细胞系，其来源于人类乳腺癌的原发灶。

这种细胞株生长速度较慢，呈悬浮状态，对雌激素敏感，可用于乳腺癌治疗药物的筛选和雌激素受体相关研究。

- T47D细胞株：T47D细胞株也是一种常用的非侵袭性乳腺癌细胞系，它是从人类乳腺癌的转移灶中建立的。

这种细胞株对雌激素敏感，并且表达雌激素受体。

T47D细胞株可用于研究乳腺癌细胞的增殖、分化以及基因表达调控等。

2. 侵袭性乳腺癌细胞株：- MDA-MB-231细胞株：MDA-MB-231细胞株是一种高度侵袭性的乳腺癌细胞系，可模拟乳腺癌的转移和侵袭过程。

这种细胞株生长迅速，可以形成肿瘤，在体内可产生肺和骨转移。

MDA-MB-231细胞株广泛应用于研究乳腺癌的转移机制、肿瘤微环境以及疗效评估。

- BT-474细胞株：BT-474细胞株是一种来源于人类乳腺癌的转移灶中的细胞株。

这种细胞株表达人类表皮生长因子受体2（HER2）的过度表达。

BT-474细胞株对药物的敏感性较高，可用于研究HER2信号通路的调控及其在乳腺癌中的作用。

3. 耐药性乳腺癌细胞株：- MCF-7/ADR细胞株：MCF-7/ADR细胞株是已知的耐药性乳腺癌细胞株之一。

这种细胞株对化疗药物多药耐药性发生，可用于研究药物耐药机制以及开发新的治疗策略。

- MCF-7/TAM细胞株：MCF-7/TAM细胞株是一种对于抗雌激素药物铁曲红素（TAM）耐药的细胞系。

该细胞株经长期的体内暴露于TAM药物而产生耐药性，可用于研究抗雌激素治疗耐药机制。

MCF-7人乳腺癌细胞MCF-7细胞描述：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。

该细胞含有Tx-4癌基因。

肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。

抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。

MCF-7细胞增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。

请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。

货号规格培养基运输保存C00401×106个/管DMEM+10% FBS干冰运输液氮保存质量控制：本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。

培养条件：37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。

细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作）收到复苏好的贴壁细胞的处理方法：1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜；2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉；3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时；4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基；5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜；6. 第二天传代。

收到冻存细胞的处理方法：1.37°C水浴预热培养基；迅速搅动2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧)；6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

细胞传代1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；。