还原糖总糖测定35二基水杨酸比色法
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实验二十还原糖和总糖含量的测定—35-二硝基水杨酸比色定糖法
实验二十还原糖和总糖含量的测定—3、5-二硝基水杨酸比色定糖法目的要求1、掌握3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2、用3，5-二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。
3、熟悉721型光电比色计的原理及使用方法。
实验原理3，5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
试剂和器材1.试剂（1）6mol/L盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、碘化钾-碘溶液（碘试剂）、酚酞指示剂、85%乙醇。
（2）3，5-二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：甲液——溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液——称取255g酒石酸钾钠，加到300ml 10%氢氧化钠中，再加入880ml 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得到黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10d以后使用。
（3）0.2%葡萄糖标准液：准确称取200mg分析纯的葡萄糖（预先在70℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。
2.器材试管和试管架、碱滴定管（50ml）、铁架台、滴定管夹、移液管（1ml，2ml）、移液管架、容量瓶（100ml）、铜水浴锅、玻璃漏斗、烧杯、铁三脚架、量筒（10ml、100ml）、电热恒温水浴、煤气灯、玻璃棒、白瓷板、721型分光光度计。
操作方法1.葡萄糖标准曲线的制定取9支刻度试管（25ml）或血糖管，分别按下表顺序加入各种试剂：DNS试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5（ml）加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水（ml）21.5 21.5 21.521.521.521.521.521.5 21.5 将上述各管溶液混匀后，在721型分光光度计上进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值,以葡萄糖浓度为横座标，光密度值为纵座标绘制出标准曲线。
总糖和还原糖的测定
待测样品旳OD540平均值在原则曲线上 查出相应旳糖含量。
朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律
朗伯－比尔定律是比色分析旳基本原理， 这个定律是有色溶液对单色光旳吸收程度与 溶液及液层厚度间旳定量关系。此定律是由 朗伯定律和比尔定律归纳而得。
A或D=㏒I0/I
A或D＝光吸收或光密度
I0 ＝入射光强度 I ＝透射光强度
三、试剂和器材
试剂：
DNS试剂 葡萄糖原则溶液 ； 6M HCl；碘－碘化钾溶液； 6M NaOH；0.1% 酚酞指示剂。
材料
藕粉，玉米淀粉
器材
容量瓶,试管，移液管，量 筒，胶头滴管，漏斗
50℃水浴，沸水浴，分光 光度计等。
四、操作环节
1.葡萄糖原则曲线制作 2.还原糖旳提取
藕粉改为称1.0克，50℃水浴20min浸出， 水浴锅中进行 3.总糖旳水解及提取 玉米淀粉测总糖，沸水浴20min酸水解，电 磁炉中进行 4.样品含糖量旳测定
试验三 总糖和还原糖旳测定
——3,5二硝基水杨酸(DNS)法
一、目 旳
掌握还原糖和总糖旳测定原理 掌握分光光度计旳使用
二、原 理
还原糖：指具有自由醛基或酮基旳糖类
单糖: 不能被水解成更小分子旳糖,单糖都是还原糖 葡萄糖, 果糖
寡糖: 最主要旳是双糖：Maltose（麦芽糖 ）,Sucrose（蔗糖） Lactose（乳糖 ） 但Sucrose不是还原糖 多糖: 能水解成多种单糖分子,如淀粉,糖原和纤 维素
样品旳透射比或吸光度值。样品读数三遍，取平均值。 7).使用分光光度计时带测定样品、洗瓶、废液杯、笔和本。
移液器旳使用手法，两档位
吸液
放液
八、思索题
1.比色时为何要设计空白管？
朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律
朗伯－比尔定律是比色分析旳基本原理， 这个定律是有色溶液对单色光旳吸收程度与 溶液及液层厚度间旳定量关系。此定律是由 朗伯定律和比尔定律归纳而得。
A或D=㏒I0/I
A或D＝光吸收或光密度
I0 ＝入射光强度 I ＝透射光强度
三、试剂和器材
试剂：
DNS试剂 葡萄糖原则溶液 ； 6M HCl；碘－碘化钾溶液； 6M NaOH；0.1% 酚酞指示剂。
材料
藕粉，玉米淀粉
器材
容量瓶,试管，移液管，量 筒，胶头滴管，漏斗
50℃水浴，沸水浴，分光 光度计等。
四、操作环节
1.葡萄糖原则曲线制作 2.还原糖旳提取
藕粉改为称1.0克，50℃水浴20min浸出， 水浴锅中进行 3.总糖旳水解及提取 玉米淀粉测总糖，沸水浴20min酸水解，电 磁炉中进行 4.样品含糖量旳测定
试验三 总糖和还原糖旳测定
——3,5二硝基水杨酸(DNS)法
一、目 旳
掌握还原糖和总糖旳测定原理 掌握分光光度计旳使用
二、原 理
还原糖：指具有自由醛基或酮基旳糖类
单糖: 不能被水解成更小分子旳糖,单糖都是还原糖 葡萄糖, 果糖
寡糖: 最主要旳是双糖：Maltose（麦芽糖 ）,Sucrose（蔗糖） Lactose（乳糖 ） 但Sucrose不是还原糖 多糖: 能水解成多种单糖分子,如淀粉,糖原和纤 维素
样品旳透射比或吸光度值。样品读数三遍，取平均值。 7).使用分光光度计时带测定样品、洗瓶、废液杯、笔和本。
移液器旳使用手法，两档位
吸液
放液
八、思索题
1.比色时为何要设计空白管？
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。
本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。
一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。
2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。
3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。
将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。
在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。
(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。
(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。
(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。
(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。
(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。
(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。
二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。
然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。
在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。
还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。
三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
百度文库- 让每个人平等地提升自我实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
总糖和还原糖的测定
总糖和还原糖的测定（3,5—二硝基水杨酸法）实验报告前言糖在我们日常生活中随处可见，我们吃的米饭、水果、零食中或多或少都含有一些糖类。
同时，糖也是我们维持机体运动所必不可少的物质，没有了它，就没有了能量的来源。
我们这次便走进实验室探索糖类的奥秘。
本次实验我们将用3,5—二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖中的含糖量。
本次实验中，我们除了要掌握还原糖和总糖的测定基本原理还要学习比色法测定还原糖的操作方法以及分光度法测定的原理和方法。
首先，让我们一起来了解一下它们的测定方法吧。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
一、实验目的1、掌握还原糖和总糖的测定的基本原理2、学习比色法测定还原糖的操作方法3、学习分光光度法测定的原理和方法二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
3,5-二硝基水杨酸比色法测还原糖含量
6、取5中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。
（四）OD540的测量及标准曲线的制作
1、在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。
2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。
3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。
酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。
6mol/LHCl溶液
6mol/LNaOH溶液
面粉样品
0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖1g，用水定容到1000ml。
四.实验仪器
（一）每组配置
试管：10ml*10试管架：1
试管夹：2铁架台：1
移液管：1ml*25ml*2 10ml*1移液管架：1
（二）还原糖液的提取
1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏水搅匀。
2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。
3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。
（三）总糖的水解与提取
1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。
2、加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.
胶头滴管：2培养皿：1
容量瓶：100ml*3漏斗:1
烧杯:100ml*3500ml*1
（二）公用仪器
分光光度计：3比色皿：3*4
水浴锅：6蒸馏水：瓶*3
滤纸：若干称量纸：若干
废液缸：1L烧杯*3
五．操作步骤
（一）标准梯度糖液配制
分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。
（四）OD540的测量及标准曲线的制作
1、在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。
2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。
3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。
酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。
6mol/LHCl溶液
6mol/LNaOH溶液
面粉样品
0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖1g，用水定容到1000ml。
四.实验仪器
（一）每组配置
试管：10ml*10试管架：1
试管夹：2铁架台：1
移液管：1ml*25ml*2 10ml*1移液管架：1
（二）还原糖液的提取
1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏水搅匀。
2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。
3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。
（三）总糖的水解与提取
1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。
2、加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.
胶头滴管：2培养皿：1
容量瓶：100ml*3漏斗:1
烧杯:100ml*3500ml*1
（二）公用仪器
分光光度计：3比色皿：3*4
水浴锅：6蒸馏水：瓶*3
滤纸：若干称量纸：若干
废液缸：1L烧杯*3
五．操作步骤
（一）标准梯度糖液配制
分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。
实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法
实验⼀还原糖和总糖的测定35⼆硝基⽔杨酸⽐⾊法掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习⽐⾊法测定还原糖的操作⽅法和分光光度计的使⽤。
⼆、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本⽅法。
还原糖是指含有⾃由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不⼀定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是⾮还原糖。
利⽤糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可⽤酸⽔解法使其降解成有还原性的单糖进⾏测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-⼆硝基⽔杨酸则被还原为棕红⾊的 3-氨基 -5-硝基⽔杨酸。
在⼀定范围内，还原糖的量与棕红⾊物质颜⾊的深浅成正⽐关系，利⽤分光光度计，在 540 nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖⽔解为单糖时，每断裂⼀个糖苷键需加⼊⼀分⼦⽔，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料⼩麦⾯粉 (1000 g) 2 .主要仪器(1具塞玻璃刻度试管：20 mL X 11 ( 2)滤纸 (3)烧杯：100 mL X2 ( 4)三⾓瓶：100 mL X 1 ( 5)容量瓶：100 mL X3 (6)刻度吸管：1mL X 1 ； 2 mL X 2; 10 mL X 1 (7)恒温⽔浴锅(8)煤⽓炉 (9)漏⽃ (10)天平 (11)分光光度计3. 试剂(1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80 C 烘⾄恒重的分析纯葡萄糖 100 mg,置于⼩烧杯中，加少量蒸馏⽔溶解后，转移到100 mL 容量瓶中，⽤蒸馏⽔定容⾄100 mL ,混匀，4C 冰箱中保存备⽤。
( 2) 3,5-⼆硝基⽔杨酸( DNS )试剂3,5-⼆硝基⽔杨酸(DNS )试剂：称取6.5 g DNS 溶于少量热蒸馏⽔中，溶解后移⼊ 1000 mL 容量瓶中，加⼊ 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL ,再加⼊45 g 丙三醇，摇匀，冷却后定容⾄ 1000 mL 。
总糖和还原糖的测定
同组成员：朱帅、周洁、曹冲
数学表达式:
A=lg(1/T)=KCL
A为吸光度为透射率,是投射光强度比上入射光强度
C为吸光物质的浓度L为吸收层厚度K为吸收系数 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.
四、实验步骤。
器材与材料准备完毕之后，便开始按照以下步骤进行实验。首先，制作葡萄糖标准曲线。取6支20mL 具塞刻度试管编号，按下表分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
0
1
2
3
4
5
标准葡萄糖溶液\ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水\ml
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
DNS试剂\ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
接下来，提取还原糖。准确称取2.00g 食用面粉，放入100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL 蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
六、数据处理。
试管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
光密度值（nm）
0.025
0.132
0.186
0.297
0.324
0.077
0.082
0、71
0、73
y = 0.3557x - 0.0172
数学表达式:
A=lg(1/T)=KCL
A为吸光度为透射率,是投射光强度比上入射光强度
C为吸光物质的浓度L为吸收层厚度K为吸收系数 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.
四、实验步骤。
器材与材料准备完毕之后，便开始按照以下步骤进行实验。首先，制作葡萄糖标准曲线。取6支20mL 具塞刻度试管编号，按下表分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
0
1
2
3
4
5
标准葡萄糖溶液\ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水\ml
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
DNS试剂\ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
接下来，提取还原糖。准确称取2.00g 食用面粉，放入100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL 蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
六、数据处理。
试管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
光密度值（nm）
0.025
0.132
0.186
0.297
0.324
0.077
0.082
0、71
0、73
y = 0.3557x - 0.0172
植物组织中总糖及还原糖的测定
3、样品含糖量的测定: 、样品含糖量的测定 取提取液1.0ml，按上表操作。 取提取液 ，按上表操作。
五、计算： 计算
还原糖含量(µg/ g )=
还原糖含量χ1(µg) ×样液总体积 测定用样品液体积×样品鲜重(g)
总糖含量(µg/ g )=
水解后还原糖含量 (µg) ×样液总体积×0.9 测定用样品液体积×样品鲜重(g)
四、实验步骤： 实验步骤：
1、葡萄糖标准曲线的绘制 、 2、还原糖的提取 、 3、样品含糖量的测定: 、样品含糖量的测定
1、葡萄糖标准曲线的绘制: 、葡萄糖标准曲线的绘制
支试管， 取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标， 支试管 按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标， 对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
三、实验材料、仪器和试剂： 实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：苹果（约0.5 g） 、实验材料：苹果（ ） 2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 3、试剂： 、试剂：
（1）1 mg/mL葡萄糖标准液 ） 葡萄糖标准液 二硝基水杨酸（ 碱性) （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 碱性 ） 二硝基水杨酸 ）试剂(碱性 （3）6M HCl和6M NaOH ） 和
管 号 0(参比溶液 参比溶液) 参比溶液 1 2 3 4 5
还原糖提取液
葡萄糖 蒸馏水 DNS 沸水 蒸馏水 光密度值 标准液 mL mL mL OD540nm 浴 mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.0 5min 冷却
4
葡萄糖含 量（µg） ） 0 200 400 600 800 1000
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还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉；精密pH 试纸。
2. 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3. 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
（5）6M HCl 和6M NaOH各100mL。
四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20mL 具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作2. 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00g 食用面粉，放入100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL 蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。
将浸出液（含沉淀）转移到50mL 离心管中，于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。
待三角瓶中的水解液冷却后，加入1 滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH 中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。
将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色和比色取4支20mL 具塞刻度试管，编号，按表2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。
加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
五、结果与计算：计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
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一.总糖的测定食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。
还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基（-CHO）或酮基(=C=O)。
测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。
这些方法中，以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。
在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法，蒽铜比色法，斐林氏容量法。
斐林氏容量法由于反应复杂，影响因素较多，所以不如铁氰化钾法准确，但其操作简单迅速，试剂稳定，故被广泛采用。
蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内，但要求检测液澄清，此外，在大多数情况下，测定要求不包括淀粉和糊精，这就要在测定前将淀粉，糊精去掉，这样就使操作复杂化，限制了其广泛应用。
（一）铁氰化钾法1.原理：样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质，在碱性溶液中能将铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的浓度和检验滴定量可计算出含糖量。
其反应为下：C 6H12O6+6K3[Fe(CN)6] + 6KOH →(CHOH)4·(COOH)2+ 6K4［Fe(CN)6］+ 4H2O滴定终了时，稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。
2，试剂1）1％的次甲基兰指示剂2)盐酸（水解作用）3）10％和30％的NaOH溶液4）1％铁氰化钾（贮存特色瓶，临用前标定）标定步骤称蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→摇匀→65-70℃水裕15分钟→取出冷却→用30％NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1％铁氰化钾于锥形瓶中→加10％NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒→加热至沸→保持一分钟→加次甲基兰1滴→立即以糖液滴足至蓝色退去为止，记录用量。
正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液，煮沸1分钟，加指示剂一滴，再用糖液滴定至兰色褪去，计算铁氰化钾溶液的浓度。
A=(W·V)/(1000×0.95)A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量（克）V：滴定时消耗的糖液的体积W：称取纯蔗糖的量1000：稀释比0.95：换算等数3．操作方法稀释10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20％醋酸铅10ml→至沉淀完为止→加10ml10％NA2HPO4→至不在产生沉淀为止→加水至刻度→过滤－取滤液50ml→于100ml容量瓶中→按铁氰化钾标定法进行转化，中和及滴定计算糖含量总糖（以转化糖计%）= (A × 1000)/(W·V)×100A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量，W：样品的重量V：滴定时样液消耗的体积4．实验应注意（a）达终点时，过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体，隐色体容量受空气中氧所氧化，很快又变成指示剂的颜色。
（b）整个过程应在低温电炉上进行，滴定要速度，否则终点不明显（c）糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比，单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用，因此不需要水解。
（二）蒽铜的比色法1.原理：糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比，可比色定量。
2.试剂（1）硫酸锌溶液：溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中（2）亚铁氰化钾溶液：溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中（3）0.2％蒽铜试剂：溶解蒽铜0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存（4）0.1％葡萄糖液：准确称干燥葡萄糖0.1000g 定容100ml3.操作方法（1）标准曲线绘制（2）100ml容量瓶编号沸水浴加热6分钟，取出冷却→用1cm比色杯→610nm测定吸光度→作出以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵坐标的准曲线（3）样品测定称10g样品→于100ml热水加入500ml容量瓶中－加硫酸锌5ml→沸水浴5分钟→取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml，→冷却→定容500ml→过滤→吸滤液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀释液1ml，于比色管中→加10ml蒽铜试剂→摇匀→水浴加热6分钟→冷却→比色试验注意1，样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀2，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定3，此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关4，所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间二.还原糖的测定方法还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎，在果糖分子中含有淤青的酮茎，在乳糖中和麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎，因此都有还原性。
在测定还原糖时一般测定总糖时所有将糖类水解为转化糖再测定的方法都可用来测定还原糖。
（一）斐林氏容量法1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。
只是样品溶液不必以过转化，而是直接取滤液进行滴定，滤液进行滴定，滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%为好，又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调节。
10毫升费林氏A、B液混合时理论上相当还原糖量如下：葡萄糖（无水）果糖或转化糖尿病 0.0500克乳糖尿病0.0678克麦芽糖 0.0807克2试剂（1）斐林氏A液，称69.8g cp硫酸铜于100ml水中，过滤备用（2）斐林氏B液，称34.6g.cp浓流锌钠和100gcp NaOH于1000ml水中，过滤备用3方法称取样品10-20g：制备与转化同铁氰化钾法。
将样液倒入滴管中，吸取A,B液准备预滴定预滴定：吸A、B液各5ml→从滴管中加15ml样液→加热至沸→继续滴加样液→至兰色变潜→加3滴次甲基兰→在1分钟内滴定到终点达到终点时，稍微过量的转化糖，将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的红色，去碱性条件下加热糖的产物是复杂的。