第八章(3)：大分子结构

第八章（3）：大分子结构
大分子结构解析的难度
首先大分子（生物大分子，主要是蛋白 质）晶体一定没有中心中心对称，相位 不仅仅是正负号那么简单；
原子数目很多，帕特逊函数确定的原子 只能是很少很少的重原子（假如有的话， 很多情况下还没有重原子）。
实验数据误差很大。Fra bibliotek解决大分子结构相位问题的主 要方法
同晶差值傅立叶法 分子置换法 同晶置换法 反常衍射法
Isomorphous Difference Fourier Analysis：同晶差值傅 立叶法
已经知道晶体结构的大部分，需要解析余下 小部分的结构：如测定同晶型单点或多点突 变的蛋白结构（野生型的结构已知），确定 结合上小分子后的结构。
平移解
Sol_TF_1 1 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.401 88.37 0.554 0.444 Sol_TF_1 2 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.222 45.60 0.600 0.335 Sol_TF_1 3 30.56 145.90 162.75 0.599 0.156 0.201 44.52 0.601 0.332 Sol_TF_1 4 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.274 43.94 0.603 0.330 Sol_TF_1 5 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.263 42.48 0.605 0.327 Sol_TF_1 6 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.237 41.32 0.603 0.327 Sol_TF_1 7 30.56 145.90 162.75 0.600 0.156 0.390 40.43 0.607 0.326 Sol_TF_1 8 30.56 145.90 162.75 0.267 0.489 0.401 38.50 0.604 0.328 Sol_TF_1 9 30.56 145.90 162.75 0.600 0.656 0.401 27.25 0.618 0.296 Sol_TF_1 10 30.56 145.90 162.75 0.929 0.820 0.403 21.96 0.612 0.310
( F(obs) 2 F(obs) 2 )( F(calc) 2 F(calc) 2 )
C [
hkl
( F(obs) 2 F(obs) 2 )2
( F(calc) 2 F(calc) 2 )2 ]1/2
hkl
hkl
当模型分子与待测分子重合时，相关因子有 极大值。
矩阵。PB,R为晶体B的patterson函数经 C变换后得到的函数。
如果旋转晶体，其Patterson函数也以同 样的方式选转：即矩阵[C]作用于 Patterson函数P(u)得到旋转Patterson函 数PR(u)。
旋转函数就是PA和PB,R在U空间的相关函 数。
如果晶体A里的分子和晶体B里的分子类 似，那么旋转到两个分子重叠时，旋转 函数有极大值。
结果解释
Cell volume: 5101535.000
For estimated protein molecular weight 64350
Nmol/asym Matthews Coeff %solvent
1
6.6
2
3.3
81.2 62.5（比较可能）
3
2.2
43.7
4
1.7
24.9
5
1.3
6.2
先旋转，后平移。
旋转 平移
旋转问题：旋转函数
旋转函数定义为：
R(a, b,) R([C])
U PA (u)PB,R (uR )du
PA为晶体A的Patterson函数，U为晶体 A的Patterson矢量所在的球形区域。C 为a、b、g三个角度所定义的旋转变换
SCA文件：
1 -985
178.468 178.468 184.948 cell 0 0 57 17093.1 1706.4 0 0 60 23413.8 2159.6 0 0 63 109.4 917.8
data number, usually 1 batch number, no meaning 90.000 90.000 120.000 p6422
合适的分辨率范围是3~10A。有时需要 尝试不同的分辨率范围。
积分区域：通常选为球形，其半径通常 等于或小于分子的直径。有时也需要尝 试。
模型选取：易变性较强的氨基酸残基 （通过同源蛋白氨基酸残基序列比较， 可以确定残基的保守性和易变性）通常 不要；溶剂分子不要；温度因子都选为 一个合适的值；有时需要人工构建一个 P1晶胞以消除分子间原子矢量的影响。
PDB数据库
Protein Data Bank（PDB）收集了目前 解析出来的蛋白质结构；
/pdb BLAST找到同源蛋白后，可以到PDB里
下载结构。 同CCP4软件包进行分子置换法。 用CNS也可以。
注意：
由于目前解析生物大分子结构的软件有 很多，各个软件的文件格式不同，因此 格式转换很繁琐。例如用HKL2000作数 据处理得到的强度文件需要转换为二进 制文件。CCP4软件包里有很多程序就 是转换用的。
第二步：看看晶体里有什么？
溶剂含量，不对称单位中有几个分子， 是否存在非晶体学对称性等。
决定下一步解析的策略。
具体步骤
Molecular Replacement/Cell Content Analysis
输入mtz文件：atahas_94827.mtz。 输入分子量（585x110=64350）。 RUN！
Rotation function
R(1,2,3) u P2 (x)P1(x)dx
旋转函数
b
g
a
计算旋转函数注意的事项
低分辨的衍射数据通常不用，这部分数 据对旋转不敏感，而且由于溶剂散射的 影响，其精度可能较差。
高分辨的数据也不能用，这部分数据对 旋转太敏感，误差也大。
BLAST! / 输入序列，BLAST根据序列查找目前的
数据库中已有蛋白与输入序列的同源程 度。 同源度越高，成功可能性越大。
分子置换法的原理
确定了待测晶体（B）的空间群后，利 用同源的模型（A）设法找到B中分子在 晶胞中的位置（x、y、z）和取向（a、 b、g），从而得到B的结构模型，初始 相位就可获得。
MR的例子
来源于拟南芥（A. thaliana）的乙酰羟酸合
成酶AHAS（EC2.2.2.6，acetohydroxyacid synthase，过去曾被称为ALS，现在则统称 为AHAS）结构。 衍射数据取到3.0A。 模型用来源于酵母的AHAS结构。这是一个 二聚体，从PDB数据里提出一个单体作为模 型，去掉水分子。
第三步：找模型
Molecular Replacement/Molrep – Auto MR
自动化的分子置换法。 搜索模型：同源结构，可能需要CNS转
换一下从PDB下载的文件（CNS： generate_easy）。
具体步骤
Molrep中输入：mtz文件，pdb文件 注意检查mtz文件中的对称群是否正确。 如果一个不对称单位中有1个以上的分
类似的已知结构作为搜索模型 （searching model），模型的空间群不 必和待解析晶体一致。
同源的两种含义：
Homology：两条多肽链相应位点的氨 基酸不同，但是尺寸、疏水性等化学性 质类似；（positive）
Identity：两条多肽链相应位置的氨基 酸完全相同。
根据序列查找同源结构
h,k,l, I
SCA文件纪录了衍射点的强度。
没有反常衍射，所以文件没有纪录I+，I，只有I。
文件（2）
MTZ文件：二进制文件。 有以下内容：H，K，L，F_atahas，
SIGF_atahas，IMEAN_atahas， SIGIMEAN_atahas，FreeR_flag。 这个文件还没有相位信息。 看看View Files from Job的内容。
Directories&ProjectDir。 CCP4/Data Reduction/Import Scaled
Data。 Job title：可以不填； 分子置换法不用反常衍射，所以不选
Use anomalous data。
具体步骤（2）
In Project：输入sca文件（用Browse）。 Out Project自动生成mtz文件名。 可以改变文件的位置（Full path…Project/
解析结构也需要在不同软件之间反复切 换使用。
第一步：准备数据
原始数据是用HKL2000 （DENZO/SCALEPACK）得到的SCA文 件；
用CCP4转换成MTZ文件。 SCA文件记录的是衍射强度，转换为衍
射振幅记录在MTZ文件中。
具体步骤（1）
数据：atahas_94827.sca 注意设置好工作目录：CCP4中的选项
平移函数
确定了旋转的角度abg后，把旋转后的 模型分子在（待测）晶胞内作可能的 平移，计算不同平移下F的相关因子 （correlation coefficient）：
F(obs) F(calc)
R hkl
F(obs)
hkl
标准的线性相关因子（standard linear correlation coefficient）C为：
子，需要做自旋转函数，判断是否存在 非晶体学对称性，甚至整个晶体的点群 可能要重新考虑。 输出文件为搜索得到的模型（pdb文 件）。