发酵工程中的菌种共33页

某些化学诱变剂常用浓度及处理时间
诱变剂 二乙酯 浓度 0.1～1% 处理时间(min) 18～24 60～120 中止方法
硫代硫酸钠或稀释 大量稀释
亚硝基胍 0.1～3㎎/ml
4）突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌 株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这
需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真
在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然
突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。
2.自然突变的两种可能
菌种衰退，生产能力下降；
代谢更加旺盛，生产性能提高。 3.自然选育的方法——单菌落纯种分离
五、诱变育种（Mutation breeding）
1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或 化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、
诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、γ-射线、X-射线、
快中子、激光、等离子体、高压等
化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝
酸、碱基类、吖啶类物质等
诱变剂量的选择：
一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，
因此，通常诱变剂量采用致死率90%～99%的剂量， 但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低 得多（致死率在90%～99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这 种处理方法通常较单一处理的效果好。
菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106～107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
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新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
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生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
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发 酵 工 程
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（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
➢ 例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有 40U·mL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价 比黄金；而现在采用新型菌种可以达到 60000U·mL-1以上，得到晶体为纯白色，青霉素纯 度高达95%以上，成本不到0.1元。
➢ 青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种 在其中起了关键作用。
菌种选育有何意义？
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本章内容
一、常用发酵工业菌种
二、发酵工业菌种的分离筛选
三、发酵工业菌种鉴定
四、发酵工业菌种改良
四、发酵工业菌种保藏
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第一节 常用发酵工业菌种
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➢ 工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产 菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品 的产量、质量及其成本。
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微生物菌种是决定发酵产品的工业化价值以及 发酵过程成败的关键，只有具备良好的菌种基 础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想 的发酵产品。
优良菌种都是通过菌种选育获得的。 菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、
杂交育种和基因工程育种。
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菌种选育的意义：
➢ 提供产量 ➢ 提高产品质量 ➢ 改善加工工艺和开发新产品。 ➢ 在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种
在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、
白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及
生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产
品。
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霉菌
– 曲霉属 米曲霉 黑曲霉
– 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉

是酿酒重要霉菌，也是酸性蛋 白酶和腐乳生产中的重要菌种。
2、毛霉 ( Mucor ) 鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 从我国小曲中分离出来； 能糖化淀粉且能生成少量酒精； 能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力， 常用来制作腐乳 总状毛霉 ( Mucor racemosus ) 是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地 土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到； 酒曲中常见 可制作豆豉
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、 色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌 株可利用烃类生产SCP。
（二）放线菌（actinomyces）
因其菌落呈放射状而得名 属原核微生物类群，在自然 界中分布很广，尤其在有机 质丰富的微碱性土壤中较多。 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余 种，60%左右来自放线菌）， 经济价值大
（六）噬菌体（phage）
危害以细菌和放线菌为生产菌 株的发酵工业。
烈性噬菌体 ——引起寄主细胞迅速裂解。 受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体 ——随寄主细胞的繁殖而繁殖。 含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。
吸附
释放
注入核酸
装配
合成核酸和蛋白质
二、微生物工业对菌种的要求 1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。
第一节 发酵工程菌种的分离和筛选
一、菌种的来源 向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性， 采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生 产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。

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发酵工程2发酵工业菌种
自然选育、诱变育种、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、蛋 白质工程、代谢工程技术等都被用优良生产菌 种的选育。
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发酵工程2发酵工业菌种
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管）
原种特性考擦
斜面
或摇瓶培养24h
小试 培养基优化
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发酵工程2发酵工业菌种
3．酵母(yeast)
酵母是单细胞真核微生物,具有典型的细
胞结构,生长温度范围在4-30℃,最适温度为25-
30℃。酵母在自然界分布很广，主要生长在偏
酸性的含糖环境中。
工业上常用的包括面包酵母、酒精酵母、
啤酒酵母、葡萄酒酵母、假丝酵母、丝赤酵母
等。用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶、单细PPT文档源自模板发酵工程2发酵工业菌种
3、富集培养 • 通过富集培养增加待分离的目标微生物的数量。 • 控制培养基的营养成分：碳源或氮源； • 控制培养条件：温度、pH、渗透压、溶解氧浓
度等。
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4、菌种分离 • 平板划线分离法 • 稀释分离法 • 涂布分离法
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•常见的工业微生物： •细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、 放线菌生长的噬菌体等 。
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发酵工程2发酵工业菌种
一、工业微生物常用菌种
1．细菌（bacteria ） 发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸
杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生 产酶制剂、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等 。
纤维素酶等，它的变异菌株可产生柠檬酸、葡萄
糖酸、草酸及抗坏血酸。

酿酒酵母
假丝酵母
红酵母
（3）霉菌 是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、 絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中， 常用的有根霉、毛霉、青霉等
根霉
曲霉
青霉
（4）放线菌 因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物 类群。分布于有机质丰富的微碱性环境中，大 多腐生，少数寄生 。最大价值在于能生产多 种抗生素，从微生物中发现的抗生素有60%以 上的是来自于放线菌。 常用的有链霉菌属、小单孢属等。
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用 透明圈法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊 状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形 成清晰的透明圈

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的 依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板 上圈的大小之间并不完全成正比。
但作为初筛的手段是有意义的
2.2.2 样品的预处理 预处理可提高菌种的分离效率，常使 用的方法有： （1） 物理方法： ① 热处理：常用来减少样品中的细菌数。 ② 膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生 物细胞。 （2） 化学方法： 在培养基中添加某些化学成分来增加 特定微生物数量。
（3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营 养的要求不同，投其所好取其所抗，使目 的菌成为人工环境下的优势菌。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
1 土样选择 如酵母菌 果园 产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂 高温酶产生菌 火山或温泉 耐压菌 油井或海洋深处
2 采样深度 离地表5-25cm处较好。
3 季节条件 避免雨季，一般以秋季最理想。 4 采样方法 用无菌器具按规范取样，记录采样地 点、时间、环境情况等以备考证。

提高发酵产品质量：通过保藏和管理，可以保证发酵产品的质量和产量， 提高经济效益。
促进科学研究：通过保藏和管理，可以积累大量的菌种资源，为科学研究 提供重要的材料。
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汇报人：XX
霉菌是一种真 菌，广泛存在
于自然界中
霉菌在发酵工 业中具有重要 的应用价值， 如酿酒、制醋、
制酱等
霉菌的种类繁 多，常见的有 曲霉、青霉、
红霉等
霉菌的生长条 件包括温度、 湿度、氧气等， 需要适宜的环 境才能生长繁
殖
细菌
乳酸菌：用于乳制品、饮料、食品 等发酵
霉菌：用于酱油、醋、腐乳等发酵
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基因重组：通过 基因工程将目标 菌株中的基因进 行重组，实现基 因的优化和表达
菌种改良：通过 基因转移和基因 重组，实现菌种 的改良和进化， 提高菌种的性能 和产量
应用领域：基因 转移和基因重组 育种在发酵工程、 生物制药、环境 保护等领域具有 广泛的应用前景
代谢工程和系统生物学在菌种改良中的应用
菌种管理规定和操作规范
菌种来源：实验室、 自然环境、其他来 源
菌种保藏：低温、 干燥、无菌等条件
菌种管理：定期检 查、记录、更新等 操作
操作规范：无菌操 作、避免污染、正 确使用等要求
菌种保藏和管理的意义和作用
确保菌种活性：通过保藏和管理，可以保持菌种的活性和稳定性，提高发 酵效率。
防止污染：通过保藏和管理，可以防止菌种受到其他微生物的污染，保证 发酵过程的顺利进行。
03 基因工程菌种的构建
基因工程菌种的概念和意义
基因工程菌种：通过基因工程技术 改造微生物，使其具有特定的功能 或特性
意义：基因工程菌种的构建可以提 高发酵效率、改善产品质量、降低 生产成本，具有重要的经济和社会 价值

在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。

• 脂肪酶产生菌的分离
• 为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色 圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作 为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性 的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。
• 乙醇产生菌的分离
• 通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙 醇的菌株。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
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五、自然界中细菌的分离
（三）分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 淀粉酶产生菌的分离：
• 分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为 惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过 培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来 区别产酶菌株。
• 碘可以杀菌，一旦染色就很容易把细菌杀死，而曲利 苯蓝只是对细菌有影响但不会杀死。，建议选用0.0050.01%含量。
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养
箱中存放3天。
• 在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层 含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和 NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的 电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡 白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。

卡那链霉菌
卡那霉素
产灰黄链霉菌
红色链霉菌 生二素链霉菌 林肯链霉菌 刺孢小单菌 地中海诺卡氏菌
杀稻瘟菌素-S
红霉素 螺旋霉素 林肯霉素 庆大霉素 利福霉素
第一章 发酵工业常用的菌种
五、病毒和藻类
敏感细胞：能使病毒在其中增殖的细胞称为。 病毒增殖过程分四个阶段： 1．吸附并渗入寄主细胞
2．病毒核酸的复制和其他病毒成分的合成 3．各种组成组合病毒整体
第一章 发酵工业常用的菌种
④．微球菌（Micrococcus）：生产谷氨酸 ⑤．乳酸菌（Lactobacteriaceae）:制药工业 生产右旋糖酐、多糖和人造血浆。食品行业广 泛用于乳制品工业和乳酸生产 。
⑥．大肠杆菌：卫生重要指标，制取天冬氨酸、 苏氨酸和缬氨酸。
第一章 发酵工业常用的菌种
⑦．芽胞杆菌（Bacillus）:高产淀粉酶和蛋白 酶的产生菌，还可生产多肽抗生素、氨基酸、 VB12、及2，3-丁二醇、果胶酶等。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能；
具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
第一章 发酵工业常用的菌种
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
菌落特征：大， 圆形，光滑湿 润，粘性，颜 色单调。常见 白色、土黄色、 红色。
啤酒酵母菌落
第一章 发酵工业常用的菌种
三、细菌 1、细菌的结构
第一章 发酵工业常用的菌种
2、细菌的繁殖：
细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖
第一章 发酵工业常用的菌种
3、细菌的菌落

（四）基因工程菌的稳定性
分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌； 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。 1.产生原因：（常见是分裂不稳定） ①产不含质粒的子代菌的频率； ②两种菌的比生长速率。
质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。 质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。
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３、霉菌的杂交育种
准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程． 异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面——扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。
第四章 微生物优良菌种的选育
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微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
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提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
２.原生质体融合法：
原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出
３.原生质体融合技术在微生物育种中的应用：
选育高产优质菌株 产生新的产物
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五、基因工程育种