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本操作手册适用于离心法从140ul 血清、血浆、尿液、细胞培养上清液、无细胞体液、拭子浸液中纯化病毒RNA 。
如需配合QIAcube 核酸纯化工作站实现自动化病毒RNA 纯化，请参阅QIAcbue 操作说明。
如处理更大量的样本（可多至560ul ），按照标准操作流程增加适当比例的裂解液以及载样次数即可。
针对一些病毒含量很低的样本，可参照附录中样本浓缩操作步骤对样本进行浓缩。
注意事项注意事项：：1、 所有步骤所有步骤均均于室温下室温下操作操作(15–25°C)。
2、 样本收集和离心后，血浆（未经处理，或用肝素之外的抗凝剂处理）或血清可在2–8°C 下储存至多6个小时。
如需长期保存，推荐分装后在–20°C 或 –80°C 保存。
冷冻血浆或血清样本不可反复冻融样本不可反复冻融样本不可反复冻融。
反复冻融将会促使蛋白变性沉淀，因而病毒含量降低，导致纯化得到的病毒RNA 的量减少。
并且，反复冻融形成的冷凝蛋白将有可能导致QIAamp 膜堵塞。
冷凝蛋白可通过 6800 x g 下快速离心3 分钟去除，小心吸取上清后立即进行下一步操作。
这一步骤不会影响病毒的含量。
3、 本操作步骤不适用于RNA 和DNA 分离，样本中存在的样本中存在的DNA 和RNA 会被同时纯化出来会被同时纯化出来。
如需完全去除DNA 的影响，推荐使用无细胞体液作为病毒RNA 纯化的起始样本。
含有细胞的样本，例如脑脊液、骨髓、尿液、以及大部分拭子，首先需要过滤，或者1500 x g 离心10分钟以上取上清使用。
如DNA 和RNA 已经一并完成纯化，可将洗脱液经过无RNA 酶的DNA 酶消化处理，接着热处理将DNA 酶灭活。
4、 可以纯化所有大于大于200nt 的RNA 分子分子，小分子RNA 将不能得到高效率的纯化。
本操作手册仅限内部学习使用！如有任何疑问，请联系：胡川（189****3075）准备事项准备事项：：1、 所有样本所有样本平衡至室温平衡至室温2、 Buffer AVE 平衡至室温3、 每个样本每个样本提供提供4个2ml 收集管收集管，，根据不同需要适当自备根据不同需要适当自备无无RNA 酶超净2ml 收集管/1.5ml 离心管4、 按照按照下面的配方准备下面的配方准备AW1 和AW2 BufferBuffer AW1以浓缩液的形式提供。
QIAampDNAMiniKitprotool（中文版）组织样品DNA的提取(QIAamp DNA Mini Kit)实验前注意：样品保持于室温（15-25℃）准备好水浴两组：一组56℃用于步骤3，一组70℃用于步骤5步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）Buffers AW1 and AW2按照17页说明准备如果Buffer ATL或AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之具体步骤：1.切割组织样品。
应少于25mg（脾组织则少于10mg）。
DNA产量与组织类型和大小有关。
一般，1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。
2.（剪碎）将剪成尽量小的碎块，置于2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。
（研磨）将25mg组织置于液氮中，充分研磨后倒入2ml 离心管中，加入180μl Buffer ATL。
此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。
（匀浆处理）将25mg组织置于2ml离心管中，加入不超过80μl 的PBS，匀浆器处理。
加入100μl Buffer ATL。
Buffer ATL不稀释时，推荐（研磨）。
3.加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。
proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL 存在的情况下活性已降低。
裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。
过夜处理是合理的，无不良影响。
为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。
4.短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
5.加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。
短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。
这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
6.加入200μl乙醇（96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
大致流程：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。
先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。
调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。
RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。
用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。
纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。
无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA 的极高回收率。
所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。
注意：1.样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。
否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病毒效价，最终减少产量。
此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。
若产生了沉淀，可以通过6800×g，离心3min，小心吸取上清进行实验。
2.在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。
如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。
3.如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。
为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。
如果样品中含有细胞，如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500×g 离心10分钟，然后取上清。
如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化，然后70℃，15min失活Dnase。
4.column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒效价。
流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。
上柱前，小量的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。
对大于140ul的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。
组织样品DNA的提取(QIAamp DNA Mini Kit)实验前注意：⏹样品保持于室温（15-25℃）⏹准备好水浴两组：一组56℃用于步骤3，一组70℃用于步骤5⏹步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）⏹Buffers AW1 and AW2按照17页说明准备⏹如果Buffer ATL或AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之具体步骤：1.切割组织样品。
应少于25mg（脾组织则少于10mg）。
DNA产量与组织类型和大小有关。
一般，1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。
2.（剪碎）将剪成尽量小的碎块，置于2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。
（研磨）将25mg组织置于液氮中，充分研磨后倒入2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。
此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。
（匀浆处理）将25mg组织置于2ml离心管中，加入不超过80μl的PBS，匀浆器处理。
加入100μl Buffer ATL。
Buffer ATL不稀释时，推荐（研磨）。
3.加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。
proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情况下活性已降低。
裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。
过夜处理是合理的，无不良影响。
为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。
4.短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
5.加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。
短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。
这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
6.加入200μl乙醇（96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
加入乙醇后，可能会产生白色沉淀物。
QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit使用手册一、试剂介绍二、原理和步骤简介：1.去除石蜡：使用二甲苯溶解并除去石蜡。
2.细胞裂解：使用蛋白酶K在变性条件（56℃）下裂解样本。
3.加热：90℃孵化逆转福尔马林的铰链。
4.结合：DNA结合到硅质膜上，并污染物流过硅质膜。
5.清洗：剩余的污染物被清洗出去。
6.洗脱：从硅质膜上纯化富集DNA样本。
三、所用试剂和耗材四、重要注意事项：1.石蜡样本准备：（1）4—10%福尔马林固定组织样本（2）固定时间14-24h，不宜太长易使DNA片段降解，不利于下游检测（3）完全脱水的样本优先包埋，残留的二甲苯抑制蛋白酶K的消化切片要求：（1）切片厚度：>10μm（2）切片面积：>250mm2（3）切片个数：>8片2.共纯化RNA：（1）QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取的样本RNA也会被纯化出来。
虽然RNA不影响整体PCR的反应，但可能会抑制下游一些酶的反应。
（2）如果需要提取出无RNA的DNA样本，按照protocol在样品中加入100 mg/ml RNase A。
（3）如果需要纯化RNA，可以选择RNeasy® FFPE Kit进行纯化。
3.洗脱DNA（1）允许的最小洗脱体积：20μl（2）最大洗脱体积建议不超过：100μl（3）洗脱Buffer ATE洗脱前应放在室温，加入Buffer ATE洗脱时，室温放置5min可提高DNA产量。
（4）提取的DNA样本贮藏：2-8℃可保存>24h；-20℃可保存>1周4.缓冲液准备（1）Buffer AW1：加入25ml 无水乙醇到19ml Buffer AW1浓缩液瓶中。
在瓶子标注―ethanol has been added‖出打勾，在15–25°C可保存一年。
注：使用前摇晃混匀。
（2）Buffer AW2：加入30ml 无水乙醇到13ml Buffer AW1浓缩液瓶中。
2021 年 1 月QIAamp® DSP Viral RNA Mini Kit 使用说明（手册）第 1 版供体外诊断使用61904QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden电话：+49-2103-29-0R61122786CN目录预期用途 (5)描述与原理 (6)吸附到 QIAamp 硅胶膜 (8)去除残留污染物 (8)使用 Buffer AVE 进行洗脱 (8)细胞 DNA 污染 (8)样本体积 (9)裂解 (9)载体 RNA (9)内部对照品的添加 (10)离心和真空程序 (10)在 QIAcube/QIAcube Connect MDx 上进行全自动病毒 RNA 纯化 (10)总结与说明 (12)提供的材料 (13)试剂盒内容物 (13)需要而未提供的材料 (14)警告和注意事项 (15)安全信息 (15)试剂存储和搬运 (17)标本存放和处理 (17)操作步骤 (18)开始前重要注意事项 (18)试剂和缓冲液的制备 (19)QIAamp Mini 离心柱的处理 (22)QIAvac 24 Plus 真空歧管的设置 (25)离心 (26)操作方案：样本浓缩 (27)操作方案：使用微型离心机或 QIAcube/QIAcube Connect MDx 纯化病毒 RNA (28)操作方案：病毒 RNA 纯化（真空方案） (30)质量控制 (33)局限性 (33)符号 (34)联系信息 (36)附录 (37)订购信息 (39)文档修订历史 (41)预期用途QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit 是一个利用二氧化硅膜技术（QIAamp 技术）来分离和纯化生物标本中病毒 RNA 的系统。
该产品旨在供专业用户使用，例如，在分子生物技术方面经过培训的技术员和医师。
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit 旨在用于体外诊断。
(完整word版)miRNeasyMiniKit中文版miRNeasy Mini kit实验前注意事项：1、这个实验方法是为了从组织（和/或）细胞中提取总RNA，包括小分子RNA。
2、有必要的话，可以加热使Buffer RWT中的沉淀溶解。
3、除了步骤5中的液相分离，其他操作均应该在室温下进行（15—25℃)，动作要迅速。
4、Buffer RWT and Buffer RPE原液在使用前应加入(96-100％）的乙醇（根据标签上的体积添加）。
5、在开始第一步之前，根据miRNeasy Mini Kit Handbook中的建议选择合适的打碎组织细胞的方法。
实验步骤：1、向组织或细胞中添加700μL的QIAzol裂解液,（组织的话,可以称取大概50mg，加入1ml裂解液，最后吸取700μL)选择合适的方法裂解细胞或组织。
(组织一般选用匀浆机,每一个组织大概研磨3—4次）。
2、室温（15—25℃)下孵育匀浆5分钟。
3、每管中加入140μL的氯仿（三氯甲烷)，并盖紧盖,大力晃动15s。
4、室温下孵育2—3分钟。
5、4℃离心15分钟（12000g)。
6、将上层清液转移到一个新的EP管中，注意避免不要混入下层液相，加入1。
5倍体积（通常是525μL)的无水乙醇,然后混匀.7、吸取700μL的样本转移到RNeasy®Mini 柱内，并放入2ml的收集管中。
室温离心8000g，15秒.弃掉收集管中的液体。
8、重复步骤7，收集将剩余的样本。
9、选做：根据手册附录B中的说明进行DNA酶消化（不需要使用miScript PCR system进行miRNA的鉴定).10、向离心柱内加入700μL的Buffer RWT，8000g离心，15s，弃滤液。
如果用的样本是细胞，这一步是选做的。
11、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，15s，弃滤液。
12、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，2min,弃滤液。
大致流程：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。
先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。
调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。
RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。
用特殊的Rnase-free 缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。
纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。
无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA的极高回收率。
所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。
注意：1.样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。
否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病毒效价，最终减少产量。
此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。
若产生了沉淀，可以通过6800×g，离心3min，小心吸取上清进行实验。
2.在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。
如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。
3.如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。
为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。
如果样品中含有细胞，如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500×g离心10分钟，然后取上清。
如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化，然后70℃，15min失活Dnase。
4.column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒效价。
流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。
上柱前，小量的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。
对大于140ul的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。
狂犬病液体标本提取RNA-----QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒试剂盒使用前：310μl Buffer AVE加入到310μg carrier RNA 中溶解后分装30μl每管，储存于—20℃，用时防止反复冻容超过3次。
检测前：Carrier RNA-AVE按照1：100比例加入到Buffer AVL，即一个样品使用体积为：5.6μl carrier RNA-AVE加入到0.56 ml Buffer AVL中。
检测步骤：吸取560μl 加有carrier RNA-AVE的Buffer AVL加入到1.5ml离心管中。
（如果样品体积﹥140μl 就按比例增加上述液体的体积）吸取140μl液体样本加入到上述液体中，振荡器混匀15s，室温放置10min，瞬时离心吸取560μl 酒精（96-100%）加入到上述离心管中（如果样品体积﹥140μl 就按比例增加酒精的体积），振荡器混匀15s，瞬时离心吸取630μl上步骤的液体加入到QIAamp Mini Spin Column中，8000rpm（转速大不影响结果），1min离心，弃收集管，换新收集管，重复本步骤，离剩余的630μl液体（如液体多，直到离完为止）吸取500μl Buffer AW1 到QIAamp Mini Spin Column中，8000rpm，1min离心，弃收集管，换新收集管（液体多，不必增加Buffer AW1的量）吸取500μl Buffer AW2 到QIAamp Mini Spin Column中，14000rpm，3min离心，弃收集管，换新收集管。
空离1 min弃收集管，将QIAamp Mini Spin Column放到新的1.5ml离心管中，加35μl DEPC处理水（到滤网）室温静置1—2分钟，8000rpm，1min离心，弃QIAamp Mini Spin Column直接进行逆转录或—70°C保存。
miRNeasy Mini kit实验前注意事项：1、这个实验方法是为了从组织（和/或）细胞中提取总RNA，包括小分子RNA。
2、有必要的话，可以加热使Buffer RWT中的沉淀溶解。
3、除了步骤5中的液相分离，其他操作均应该在室温下进行（15-25℃），动作要迅速。
4、Buffer RWT and Buffer RPE原液在使用前应加入（96-100%）的乙醇（根据标签上的体积添加）。
5、在开始第一步之前，根据miRNeasy Mini Kit Handbook中的建议选择合适的打碎组织细胞的方法。
实验步骤：1、向组织或细胞中添加700μL的QIAzol裂解液，（组织的话，可以称取大概50mg，加入1ml裂解液，最后吸取700μL）选择合适的方法裂解细胞或组织。
（组织一般选用匀浆机，每一个组织大概研磨3-4次）。
2、室温（15-25℃）下孵育匀浆5分钟。
3、每管中加入140μL的氯仿（三氯甲烷），并盖紧盖，大力晃动15s。
4、室温下孵育2-3分钟。
5、4℃离心15分钟（12000g）。
6、将上层清液转移到一个新的EP管中，注意避免不要混入下层液相，加入倍体积（通常是525μL）的无水乙醇，然后混匀。
7、吸取700μL的样本转移到RNeasy® Mini 柱内，并放入2ml的收集管中。
室温离心8000g，15秒。
弃掉收集管中的液体。
8、重复步骤7，收集将剩余的样本。
9、选做：根据手册附录B中的说明进行DNA酶消化（不需要使用miScript PCRsystem进行miRNA的鉴定）。
10、向离心柱内加入700μL的Buffer RWT，8000g离心，15s，弃滤液。
如果用的样本是细胞，这一步是选做的。
11、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，15s，弃滤液。
12、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，2min，弃滤液。
13、选做：将RNeasy Mini 柱移入一个新的2ml收集管内，最大转速离心1min。
QIAamp RNA提取说明书qiaamprna提取说明书试剂的准备avl缓冲液中重新加入载体rna加310ul的ave缓冲液到含310ug冻干的载体rna的管子中，获得1ug/ul的溶液。
使载体rna充分彻底地溶解并分装置于－20℃保存。
载体rna的冻融不能超过3次。
检查avl缓冲液与否存有结晶，如果存有的话可以在80℃并使结晶熔化。
根据自噬体样本数排序所含载体rna的avl缓冲液的量nx0.56ml=ymlymlx10μl/ml=zμl其中：n为样本数，y为avl缓冲液的量，z为加进avl中所含载体rna的avl缓冲液的量。
（见到说明书表格）。
病毒rna提取方案本方案就是用台式离心机从140ul的血浆、血清、细胞培养液或体液中抽取病毒的rna。
对于用qiaamp病毒rnamini试剂盒在和qia管自动抽取病毒rna的方法可以参考qia管使用指南及有关的方案。
对于从更大的样本量（560ul）中提取rna，可成比例的增加内部容积和分多次装载样本到qiaamp吸附柱上。
一些病毒量很低的样本需要在提取之前进行离心，参见“方案：样本离心”（30页）。
另外的,更大的样本量时可以采用以下能够同时抽取病毒的dna和rna的试剂盒。
qiaampminelute?spinkit*200μlqiaampminelutevacuumkit500μlqiaampultrasens?viru skit1000μl开始之前一些重要提示1、已经开始实验之前写作“关键事项”2、所有的离心步骤都是在室温下（15－25℃）进行的。
准备工作工作1、样本在室温下（15－25℃）平衡。
2、缓冲液ave在室温下均衡用作第11步中的洗清。
3、检查缓冲液aw1和aw2是否按照17页上的说明准备就绪。
4、按照15页上的表明将载体rna－ave混合缓冲液加进avl缓冲液中。
rna提取步骤1、汲取560ul包好的所含载体rna的avl缓冲液至一个1.5ml的离心管中。
大致流程：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。
先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。
调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。
RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。
用特殊的Rnase-free 缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。
纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。
无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA的极高回收率。
所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。
注意：1.样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。
否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病毒效价，最终减少产量。
此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。
若产生了沉淀，可以通过6800×g，离心3min，小心吸取上清进行实验。
2.在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。
如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。
3.如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。
为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。
如果样品中含有细胞，如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500×g离心10分钟，然后取上清。
如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化，然后70℃，15min失活Dnase。
4.column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒效价。
流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。
上柱前，小量的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。
对大于140ul的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。
如果起始样品量比较多，建议将裂解样品分多次进行上柱。
无需担心柱子会超载，纯化产物的质量也不会受影响。
样品量超过560ul时，最好先浓缩样品。
需准备的东西（分离柱法）：无水酒精（96％～100％）；1.5ml离心管；灭菌，Rnase-free枪头，离心机（适用于1.5ml 和2ml离心管）。
试剂准备：1.吸取310ul buffer A VE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul的溶液。
充分溶解后，将其分成合适的等份，－20℃冻存。
反复冻融不要多于3次。
2.检查buffer AVL的沉淀情况，必要的话可置于80℃温育至沉淀溶解。
按照表1及公式计算一批样品所需的buffer AVL-carrier RNA混合物的体积（说明书15～16页写的比较清楚，不再详述）。
轻柔的颠倒混匀10次，不要涡旋，避免产生泡沫。
（Note：buffer AVL-carrier RNA应该现用现配，2～8℃可保存48小时。
用前，存放时产生的沉淀必须在80℃加热重新溶解。
溶解次数要小于6次。
80℃加热不能超过5min。
）n x 0.56 ml = y mly ml x 10 μl/ml = z μln = number of samples to be processed simultaneouslyy = calculated volume of Buffer AVLz = volume of carrier RNA–Buffer AVE to add to Buffer AVL因此，carrier rna溶解在ave之后就大概5.6ul每管分装，或者10.2也可。
之后冻存，由于其冻融不能超过3次。
3.buffer AW1在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96％～100％）稀释。
（＃52904 19ml AW1需加入25ml乙醇）说明书17页4.buffer AW2在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇（96％～100％）稀释。
（＃52904 13ml AW1需加入30ml乙醇）说明书17页柱子的使用（分离柱法）：要避免交叉污染。
1.样品上柱时要小心，不要弄湿柱子的边缘。
2.在所有的移液步骤中注意要换枪头。
3.枪头主要不要碰到QIAamp膜。
4.斡旋后瞬时离心1.5离心管，将盖子上的液体甩下来5.全程带手套，一旦手套接触到样品，立即更换手套。
6.放入离心机离心前要盖上column。
7.将column和收集管从离心里拿出后，将column放入新的收集管内。
丢弃旧的收集管及过滤物，并妥善处置。
8.每次只打开一个column，注意避免产生悬浮颗粒离心：1.收集管用1.5ml和2ml均可2.column离心一般在6000×g（8000rpm）。
全速离心也不会影响产量。
裂解和第一次洗涤时离心速度可以稍低，保证所有的溶液都经过膜。
第二次洗涤时应该全速离心。
所有离心都可在室温下进行。
操作流程：开始前：1.使样品及buffer A VE达到室温。
2.检查buffer AW1和AW2是否按照说明配好3.根据说明将溶于buffer A VE的carrier RNA加入到buffer AVL中流程：1.吸取560ul准备好的buffer A VL（含有carrier RNA）到1.5ml离心管中。
（根据样品的实际量按比例调整buffer A VL-carrier RNA）2.将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferA VL-carrier RNA的离心管中。
斡旋15秒，混匀。
（为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。
只溶解过一次的样品也仍然可用）3.室温放置10min。
（10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。
Buffer A VL可以使潜在的污染和Rnase失活）4.瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5.样品中加入560ul无水乙醇（96％～100％），斡旋15s充分混匀。
然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
（只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。
不要用变性酒精，因为其中含有其他物质。
如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。
该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量）6.吸取630ul上步中的溶液小心的加入column（已装入到2ml离心管中）中，注意不要碰到柱子的边缘。
盖上盖子，6000×g（8000rpm）离心1min。
将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。
（每一个column都要盖上，以防交叉污染。
8000rpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。
如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过）7.小心的打开column的盖子，重复第6步。
（如果样品量超过了140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱）8.小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW1。
盖上盖子，8000rpm离心，1min。
将column放入新的2ml收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。
（即使样品量大于140ul，也无需增加buffer AW1的量）9.小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。
盖上盖子，全速离心（14000rpm），3min。
接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免buffer AW2残留，然后再进行第11步。
（buffer AW2残留会影响下游实验。
有些离心机在减速时会发生振动，导致回流，使得buffer AW2接触到column。
将column和收集管从离心机里拿出来时也可能会导致该现象产生，因此，最好先进行第10步）10.推荐：将column放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速离心1min。
11.将column放在1.5ml离心管（kit中未提供）中。
弃去旧的收集管。
小心的打开column，加入60ul 室温的buffer A VE。
盖上盖子，室温放置1min。
8000rpm离心1min。
（单次60ul buffer A VE可以洗脱膜上90％的病毒RNA。
每次40ul buffer A VL，洗两次，可以将产物量提高10％。
用小于30ul的buffer洗脱，将会降低产物量，也不会提高产物浓度。
病毒RNA在－20℃或－70℃下可以稳定保存1年。
）样品浓缩：针对病毒效价较低的样品进行，比较简单，请参阅第30页。
问题指导：详细的问题指导可参考第32～35页，内容比较简单清晰，不再详述注意事项：要注意避免Rnase污染：1.应用微生物学无菌技术。
手和灰尘是最常见的Rnase污染源，所以操作过程一定要带手套，勤换手套。
尽可能的保证管子盖着。
操作过程中，动作要迅速，以避免RNA降解。
2.过程中建议使用一次性管子。
这些管子通常是无Rnase污染的，而且无需前处理（例如Axygen的产品）3.非一次性器材在用前一定要进行处理，以避免Rnase污染。
塑料制品应该用0.1MNaOH，1mM EDTA浸泡，然后用Rnase-free水浸泡。
耐氯仿的制品也可以用氯仿浸泡。
4.玻璃器皿用前可以用去垢剂彻底浸泡，然后大于240℃烘箱烘4小时或更长（过夜）。
也可以用DEPC处理。
用0.1％DEPC 于37℃浸泡过夜，然后高压灭菌或100℃，15min以去除DEPC。
5.电泳仪要用去垢剂（例如，0.5％ SDS）清洁，用水浸泡，用乙醇干燥，然后添入3％ H2O2。
室温放置10min，然后用Rnase-free 水浸泡。
6.水应该用0.1％的DEPC进行处理。
除试剂盒中的试剂外，其他试剂也需DEPC处理。
加0.1％ DEPC到100ml需处理的溶液中，轻摇使DEPC溶入溶液中，或者将溶液于37℃烘12小时。
高压灭菌15min除去残留DEPC。
