第14章 高效液相色谱法

二、γ-氨基丁酸的高效液相色谱测定法本方法适用于保健食品中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）的测定。

本方法γ-氨基丁酸的检出限为10ng。

1.方法提要γ-氨基丁酸用异硫氰酸苯酯柱前衍生，衍生物采用氨基酸分析柱分离，二元流动相梯度洗脱，248nm波长下紫外检测器检测，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。

2.仪器（1）高效液相色谱仪，配紫外检测器。

（2）旋涡混合器3.试剂本方法除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

（1）乙腈：色谱纯。

（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：吸取0.5mL异硫氰酸苯酯，加入40mL乙腈溶解。

（3）盐酸溶液（0.1mol/L）：取分析纯浓盐酸8.3mL，加水稀释至1L。

（4）三乙胺-乙腈溶液：15mL三乙胺与85mL乙腈混合而成。

（5）γ-氨基丁酸标准品：纯度99.9%，Sigma公司。

（6）γ-氨基丁酸标准溶液：精确称取γ-氨基丁酸10mg，置于10mL容量瓶中，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释到刻度，摇匀，得浓度为1mg/mL的标准储备溶液。

将此标准储备液用0.1mol/L盐酸溶液稀释成浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的标准溶液系列。

（7）醋酸钠溶液：0.05mol/L，用作流动相A。

（8）乙腈-水溶液：乙腈-水（80+20），用作流动相B。

（9）正己烷。

4．测定步骤（1）供试样品溶液的制备1）提取：称取适量样品(相当于γ-氨基丁酸4mg，精密至0.001g)，置于100mL三角烧瓶中，加入盐酸溶液(0.1mol/L)适量，40℃超声提取20min，冷却，转移至100mL容量瓶，加盐酸溶液(0.1mol/L)至刻度，摇匀，静置，取适量过滤，得样品提取液。

2）衍生化：取样品提取液0.2mL，置于5mL具塞试管中，加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液0.4mL，再加三乙胺-乙腈溶液1.4mL，摇匀，放置1小时，然后加入正己烷2mL，漩涡混合1min，静置，取下层液体作为待测溶液。

高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。

高效液相色谱法分析食品中的残留农药第一章：引言在食品安全问题日益引起人们的关注的背景下，残留农药成为一个备受关注的话题。

近年来，残留农药对食品安全和人体健康造成了一定的威胁。

因此，分析食品中的残留农药的方法和技术变得至关重要。

本文将介绍一种常用的分析方法——高效液相色谱法（HPLC），并探讨其在食品中检测残留农药方面的应用。

第二章：高效液相色谱法概述2.1 高效液相色谱法原理高效液相色谱法是一种基于分离技术的分析方法，其原理是将待分析的混合物溶解在溶剂中，并通过高压将其进样到色谱柱中，然后使用流动相沿着色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。

高效液相色谱法具有分辨率高、灵敏度好、选择性强等特点，被广泛应用于各个领域，特别是食品检测领域。

2.2 高效液相色谱法的仪器设备高效液相色谱法依赖于多种仪器设备，包括进样器、色谱柱、流动相泵和检测器等。

其中，进样器用于将待分析样品引入色谱柱，色谱柱用于样品的分离，流动相泵用于提供流动相进行分离过程，检测器则用于定量分析分离后的化合物。

第三章：高效液相色谱法在食品中的应用3.1 高效液相色谱法分析食品中的残留农药的流程在分析食品中的残留农药时，首先需采集样品并根据需要进行前处理以去除可能的干扰物，然后将样品溶解于适当的溶剂中，通过进样器将样品引入色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。

3.2 高效液相色谱法在不同食品中的应用高效液相色谱法广泛应用于各类食品中残留农药的分析。

例如，在蔬菜中，可以使用高效液相色谱法对杀菌剂、除草剂等农药进行分析。

在水果中，可以使用高效液相色谱法对杀虫剂、杀菌剂等农药进行分析。

此外，高效液相色谱法还可以应用于粮食、肉类等食品中残留农药的分析。

3.3 高效液相色谱法的优势和不足高效液相色谱法在食品中分析残留农药方面有许多优势。

其具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。

然而，高效液相色谱法也存在一些不足之处，如需要专业的仪器设备和技术支持，分析周期长等。

PTCA(PARTB: CHEM. ANAL.)工作商报D O I ： 10.11973 lh jv-h x202101012高效液相色谱法测定造影剂碘普罗胺中的相关杂质徐川龙，泮彩平(浙江司太立制药股份有限公司.台州317300)摘要：提出采用高效液相色谱法测定一种非离子型碘造影剂碘普罗胺中5种杂质含量的方 法。

以Eclipse C 18 P l u s 色谱柱为分离柱，以不同体积比混合的水和体积比为55 : 40 : 5的水-乙 腈-2-丁醇混合溶液为流动相进行梯度洗脱，在检测波长245 n m 处对5.0 g . L 」的样品溶液中的 5种杂质进行测定。

结果显示：杂质1〜5标准曲线的线性范围分别为2.57〜51.4 mg . L — 1,5.05〜101 mg • L 1,2.56〜51.2 mg . L 、1.01 〜20.2 mg . L —】，0.51 〜10.2 mg • L . 1。

检出限 (3S /N )分别为0.10,0.20,0.15,0.12,0.10 mg . L 、对实际样品进行3个浓度水平的加标回收试 验，杂质1〜5的回收率分别为105%,93.7%，95.2%,97.8%，112%,重复性和中间精密度试验结 果显示，杂质1〜5测定值的相对标准偏差（w =6)均在15%以内。

关键词：高效液相色谱法；造影剂；碘普罗胺；相关杂质中图分类号：0657.7文献标志码：A文章编号：1001-4020(2021)01-0062-0598%。

杂质2对照品：批号2188-015A 9,纯度不小于98%。

杂质3对照品：批号WS -1301-1，纯度不小于 97%。

杂质4对照品：批号WS -1301-1，纯度不小于97%。

杂质5对照品：批号2120-070A 2，纯度大于 98%。

乙腈和2-丁醇为色谱纯，使用前经过0.2 p m 滤 膜过滤；试验用水为经Milli -Q 再次纯化的纯水；试 验所用样品（批号C 025-160800)由浙江司太立制药 股份有限公司提供。

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。

它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。

仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。

流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。

高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。

与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。

同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。

因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。

在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。

通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。

例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。

在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。

通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。

在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。

通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。

在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。

高效液相色谱法的常见问题及解决方法高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题，如何解决这些问题呢?1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?关于漂移问题：①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定;②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等;③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡;关于快速变化问题①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定;②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出;③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合;2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子;②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子;③可能柱超载，减少进样量;3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法①样品量不足，解决办法为增加样品量;②样品未从柱子中流出。

可根据样品的化学性质改变流动相或柱子;③样品与检测器不匹配。

根据样品化学性质调整波长或改换检测器;④检测器衰减太多。

调整衰减即可;⑤检测器时间常数太大，解决办法为降低时间参数;⑥检测器池窗污染。

解决办法为清洗池窗;⑦检测池中有气泡。

解决办法为排气;⑧记录仪测压范围不当。

调整电压范围即可;⑨流动相流量不合适。

调整流速即可;⑩检测器与记录仪超出校正曲线。

解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;②比例阀失效，更换比例阀即可;③泵密封垫损坏，更换密封垫即可;④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;⑤系统检漏，找出漏点，密封即可;⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

高效液相色谱法试验操作规程目的：建立一个高效液相色谱法试验操作规程，保证此项工作顺利进行。

范围：原料、中间体、成品检验。

责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。

内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

1.1色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。

常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。