QPCR步骤（1）

1 qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1. 找基因（DNA） 1) 通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2) 通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3) 通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4) 找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存序列。 2 2. qPCR引物和TaqMan探针的设计 1) 引物设计注意事项 a) 引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b) 扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c) 引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距不超过1℃，推荐使用 Primer Premier 5进行Tm值计算； d) 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e) 引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f) 3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能搭上 g) 特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的GC互搭 h) 引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i) 引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j) 正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k) 在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l) 需跨外显子设计，避免基因组污染 2) TaqMan探针设计指南 a) 探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b) 应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c) 探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用 d) 3’端应避免使用碱基A 3 e) 如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。 f) 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A因为A、T为双键，而G、A为三键。 g) 探针长度：Taqman探针的长度最好在25-32bp之间（一般为18-40bp），且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃（至少要5℃），这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。GC含量在40%-70%。 3) 利用软件Primer Premier 5进行设计 打开软件，点击File→New→DNA Sequence→复制粘贴基因序列→点击Primer →点击Search→设置对应参数（可调整）→点击OK 4 →查看系统推荐的正、反向引物，在此基础上可点击“Edit Primers”进行自主调整（增删碱基，移动位置等），直至筛选出最优的正、反向引物。 4) 利用NCBI官网的Primer-BLAST进行设计 在Primer-BLAST网页左上边框粘贴基因序列，设置相应参数，点击网页左下角的“Get 5 Primers”进行搜索即可。（方便直接看到引物可能扩增的其他物种序列） 3. 质量鉴定 1) 利用软件PrimerSelect对引物和探针进行评估 打开软件PrimerSelect（在软件DNASTAR里面可以找到）→新建日志 →输入要进行比对的引物和探针序列→选择要比对的序列→点击Report即可输出相应的比对数据 （因为部分序列已经在Primer Premier 5比对过了，所以只要在此处比对正向探针和反向引物，或者反向探针和正向引物即可） 6 3’端尽量不要搭上 2) 利用Primer-BLAST查看引物可能扩增的序列（重要！） 在Primer-BLAST网页输入设计好的正、反向引物序列→点击“Get Primers”进行搜索即可（若不止出现目的病毒序列，还出现了检测物种身上的其他病毒序列，则引物需要重新设计） 4. 引物和探针的合成 1) 设计合成基因序列所需的引物 （若需要检测多个病毒，合成阳性模板，可将需要检测的病毒的扩增序列拼接在一起，最7 好不超过500bp） 百度搜索DNAWorks，进入基因合成的网站 →填写名称（必须包含大写字母、小写字母和数字，不能加横杆或其他字符） →填写网易邮箱 →选择相应的物种（做真核表达时需尤其注意，其他可根据需要进行选择） →设置相应的参数 →粘贴需要合成的基因序列→点击“Design Oligos”，等待邮件（一般几分钟即可收到） →打开收到的邮件，查看引物评分，评分尽量保证在“5”以下，越趋近于“0”越好 8 →复制粘贴引物序列，送往引物合成公司进行合成即可 2) 合成引物 a) 普通PCR引物用脱盐纯DSL即可 b) qPCP引物用PAGE纯，探针用HPLC纯 c) 探针5’端荧光基团选择顺序“FAM→HEX→ROX, CY5”，3’端猝灭基团选择顺序“BHQ→TAMRA→Eclipse”

Real-time qPCR 检测

操作手册

1/ 6一、实验概述

Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也

叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，

利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分

析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

二、实验流程

三、实验材料：

1.主要试剂

试剂名称 试剂来源 Cat.No.

Trizol 上海普飞 3101-100

M-MLVpromega M1705

dNTPs promega U1240

oligo dT 上海生工 B0205

Bulge-LoopTM miRNA 广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set

Rnase Inhibitor promega N2115

Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告

SYBR Master Mixture TAKARA DRR041B

2/ 6样本收集

Trizol法抽取RNA

RNA反转录获取cDNA

Real-time qPCR 2.主要器材

器材名称 来源 Cat.No

Nanodrop 分光光度计 Thermo 2000/2000C

稳压电泳仪 上海天能 EPS-600

超细匀浆机 FLUKO公司 F6/10

Real time PCR 仪器 Agilent公司 MX3000p

反转录耗材 Axygen

四、实验步骤：

1.总RNA 抽提

（1）收取样品，Trizol 裂解。细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清， 细胞

沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；

组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将

qPCR操作步骤 精品文档

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标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.

注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。

2 减少加样误差， 在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。

3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。

4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。

Q-PCR实验流程：

一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。

Q-PCR实验流程

一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、 总RNA抽提

1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；

组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）

2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）

3） 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）

4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；

5） 4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；

6） 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。 7） 视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。