鹿蹄草的有效成分提取及其防腐性能探究

广东化工2019年第18期

·16·www.gdchem.com第46卷总第404期

鹿蹄草的有效成分提取及其防腐性能探究

梁垚丰1，叶彦锴1，邓金生2，刘蕤1，何秋星1*

(1．广东药科大学医药化工学院，广东中山528458；2．广州今盛美精细化工有限公司，广东广州510440)

[摘要]本文以黄酮和多酚作为考究指标，采用正交实验法探讨了鹿蹄草的提取工艺，并对其抑菌性能进行了表征。研究结果表明采用乙醇

回流法提取鹿蹄草活性物的最优提取工艺条件分别为固液比1∶15，45%乙醇为溶剂，提取温度85℃，提取时间3h；鹿蹄草提取液对金黄色

葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、酵母菌MIC分别为0.15、0.1、0.3、0.35g/mL，对黑曲霉却无抑制作用。鹿蹄草提取液有一定的抑菌作用，

可以作为化妆品潜在原料。[关键词]鹿蹄草；提取；抑菌

[中图分类号]TQ[文献标识码]A[文章编号]1007-1865(2019)18-0016-03

StudyontheExtractionProcessofActiveComponentsfromWintergreenandIts

AntisepticProperties

LiangYaofeng1,YeYankai1,DengJinsheng2,LiuRui1,HeQiuxing1*

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528458；

2.GuangzhouJinShengMeiFineChemicalCo.,Ltd.,Guangzhou510440,China)

Abstract:Usingflavonoidsandpolyphenolsasindicators,theextractionprocessofwintergreenwasstudiedbyOrthogonalexperimentmethod,andits

antibacterial,antioxidativeandirritatingpropertieswerecharacterized.Theresultsshowthattheoptimalprocessforextractingtheeffectivematerialofwintergreen

byethanolrefluxmethodissolid-liquidratio1∶15,45%ethanolassolvent,extractiontemperatureis85℃,extractiontimeis3h;Theminimuminhibitory

concentrationofthewintergreenextractwas0.15,0.1,0.3,0.35g/mLagainstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliandPseudomonasaeruginosaandyeast,

butithadnobacteriostaticeffectonAspergillusniger.Thewintergreenextracthasacertainantibacterialeffectandcanbeusedasapotentialrawmaterialfor

cosmetics.

Keywords:Wintergreen；extraction；Bacteriostatic

1前言

鹿蹄草，又名鹿衔草、鹿含草，是鹿蹄草科、鹿蹄草属的常

绿草本状小半灌木，生于海拔700~4100m山地针叶林、针阔叶混

交林或阔叶林下[1]，在我国分布广泛。鹿蹄草性味苦、甘温，入

肺、胃、肝经，能祛风湿、强筋骨、补虚益肾、活血调经、止咳

止血，具有优良的药用价值，是一种重要的医药材料。鹿蹄草的

化学成分包括黄酮类、酚类、醌类、萜类、多糖、氨基酸等[2]。

黄酮类化合物为鹿蹄草的主要成分，其中包括金丝桃苷、儿茶素[3]、槲皮素等；多酚类化合物为鹿蹄草的重要成分，主要包括鹿

蹄草苷、高熊果酚苷、没食子酸等[4]；其他成分如醌类物质包括鹿蹄草素、大黄素[5]等，萜类则包括熊果酸、齐墩果酸[6]等。鹿蹄草主治金创出血、吐血衄血、蛇虫咬伤、风湿痹痛、腰

膝酸软、崩漏等[7]。对于皮肤性疾病，鹿蹄草煎液外用可以治疗

过敏性皮炎，疮痈肿毒等。鹿蹄草在化妆品上应用较少，目前只

有少量用于治疗粉刺或者作为添加物预防皮肤疾病发生的报道。

本论文通过对鹿蹄草活性物提取方法的研究及其活性研究，为鹿

蹄草提取物在化妆品中的应用提供依据。2实验部分

2.1实验主要仪器与材料

本实验所需实验试剂及仪器见表1和表2，所用菌种均来自

广东微生物研究所。

表1试剂与药品试剂级别厂家

鹿蹄草中药级康德瑞琪贸易有限公司

槲皮素标准品分析纯成都普菲德生物技术有限公司

没食子酸标准品分析纯成都普菲德生物技术有限公司

卡松化妆品级德国舒美有限公司

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼分析纯上海麦克林生化科技有限公司

营养琼脂培养基-广东环凯微生物科技有限公司

卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基广东环凯微生物科技有限公司

虎红培养基-广东环凯微生物科技有限公司

福林酚试剂-福州飞净生物科技有限公司

表2所用仪器

仪器型号厂家

蒸发旋转仪RE-5A上海亚荣生化仪器厂

紫外-可见光光度计UV1000上海天美科学仪器有限公司

高温灭菌锅LD-5BS上海申安医疗器械厂

细菌比浊仪WZT-上海劲佳科学仪器有限公司

恒温孵化箱DZ47-63德州市运河经济开发区驿洲孵化设备厂

[收稿日期]2019-07-24

[基金项目]本项目受省、市重点学科建设专项资金支持

[作者简介]梁垚丰(1995-)，女，广东肇庆人，研究生，主要研究方向为天然植物化妆品的研究与开发。*为通讯作者：何秋星，博士。2019年第18期广东化工

第46卷总第404期www.gdchem.com·17·

2.2鹿蹄草活性物的提取工艺

将鹿蹄草粉碎后，称取一定量鹿蹄草粉末，以酒精为溶剂进

行冷凝回流，将提取液减压抽滤，滤液经旋转蒸发后浓缩、定容

至10mL备用，以黄酮及多酚作为综合指标利用紫外分光光度计

进行测量，并采用下列公式计算综合分数。2.3鹿蹄草提取液的性能检测

2.3.1NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定黄酮含量

(1)称取5mg槲皮素标准品，用50%酒精溶解后转移至25mL

容量瓶中定容，摇匀，使成0.2mg/mL的槲皮素对照品溶液。(2)于10mL容量瓶中分别加入一定量的槲皮素对照品溶液及

鹿蹄草提取液，各加入50%酒精使成5mL，精确加入0.3mL5%NaNO₂溶液，摇匀放置6min后，加入0.3mL10%Al(NO3)3溶液，

摇匀放置6min，最后加入4mL4%NaOH溶液，用50%酒精定

容至刻度，摇匀后静置15min。以50%酒精为参比，用紫外分光

光度法在300~600nm波长范围内扫描，得最大吸收波长。同样方

法分别加入1、2、3、4、5mL0.2mg/mL槲皮素对照品溶液，于

最大吸收波长下测其浓度为0.2~1mg/mL时的吸光度，作标准曲

线。(3)取1mL鹿蹄草提取液于10mL容量瓶中，加入50%酒精

使成5mL，后用(2)中方法测定其吸光度，将结果代入标准曲线求

得黄酮含量，并计算黄酮提取率。2.3.2多酚含量的测定

(1)分别精确称取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75mg没食子酸

对照品，用去离子水配成0.015、0.03、0.045、0.06、0.075mg/mL

的没食子酸对照品溶液。(2)于10mL容量瓶中分别加入一定量没食子酸对照品及鹿蹄

草提取液，加入2mL去离子水，再加入0.5mLFolin试剂，迅速

摇匀，反应6min后加入4mL7.5%碳酸钠溶液，用去离子水定

容，摇匀后避光暗反应1h。以去离子水为参比，用紫外分光光度

法在200~800nm波长范围内扫描，得最大吸收波长。同样方法分

别加入五个浓度的没食子酸对照品溶液，于最大吸收波长下测其

浓度为0.015~0.075mg/mL时的吸光度，作标准曲线。(3)取1mL鹿蹄草提取液于10mL容量瓶中，加入2mL去离

子水，后用(2)中方法测定其吸光度，最后将结果代入标准曲线求

得多酚含量，计算多酚提取率。2.3.3抑菌性能评价

2.3.3.1K-B纸片扩散法

(1)金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌使用营养琼脂培养

基，酵母菌、黑曲霉使用虎红琼脂培养基。分别取营养琼脂培养

基干粉33g，虎红琼脂培养基干粉31.6g，各加入去离子水1L

后搅拌加热煮沸至完全溶解。将培养基于121℃高压灭菌20min

后备用。(2)用打孔器将滤纸制成6mm的小圆纸片，每个平皿分散放

置同等数量的滤纸片，121℃高压灭菌后取出。干燥后于八个平

皿中分别加入6mL0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8g/mL

的鹿蹄草提取液，使其充分浸泡纸片后备用。另取纸片平皿加入6mL0.85%无菌生理盐水浸泡，作空白对照；加入6mL0.05%

卡松浸泡，作阳性对照。(3)供试菌种活化后，将细菌接种至灭菌的卵磷脂-吐温80营

养琼脂斜面培养基中，在37℃下培养2d；真菌接种至灭菌的虎

红琼脂斜面培养基中，在28℃下培养3d。培养后取出试管，用

无菌生理盐水将菌种洗出，稀释，细菌悬液用麦氏比浊仪，真菌

悬液用紫外分光光度计测定稀释成含菌数为105~106的菌悬液备

用。(4)于平皿中分别倒入适量营养琼脂培养基和虎红琼脂培养

基，待其凝固后，打入0.1mL对应的菌种，用涂布器涂抹均匀，

稍待其吸收后贴入药敏片。其中，每个实验培养基贴入3枚相同

浓度的鹿蹄草提取液浸泡纸片，1枚无菌生理盐水浸泡纸片做空

白对照；阳性对照组贴入四枚卡松浸泡纸片。细菌和真菌分别培

养1d和2d后取出观察。用卡尺测量抑菌圈直径并记录，若抑菌

圈直径大于7mm为有抑菌效果，抑菌圈直径小于或等于7mm

为无抑菌效果。2.3.3.2最低抑菌浓度(MIC)实验

(1)MIC实验使用PDA液体培养基。将马铃薯去皮，切成小

块，称取200g放入烧杯中，加入1L去离子水，煮沸20min后

将马铃薯液全部倒出，趁热经四层纱布过滤多次，弃去滤渣，加

入去离子水补至1L，再加入20g葡萄糖，搅拌溶解后继续加热

至沸腾，即为PDA培养基。将配好的培养基分装于锥形瓶中121℃灭菌20min后备用。

(2)根据抑菌圈实验的实验结果适当缩小药液浓度范围，在

0.05至0.40g/mL之间梯度选取浓度稀释提取液。

(3)菌液准备与抑菌圈实验相同。实验时，于4mLep管中分

别加入1mLPDA培养基，1mL药液以及0.1mL菌液，作为实

验组。设置阴性对照组，同样于4mLep管中加入1mL药液及1mLPDA培养基，但不加入菌液。设置阳性对照组，加入2mLPDA

培养基及0.1mL菌液，不加入药液。设置空白对照组，只加入2mLPDA培养基。细菌于37℃下培养，真菌于28℃下培养，18~24

h后取出观察，将实验组与阴性对照组进行对比，若为清澈透明

则判断为无菌生长，抑菌有效。实验结果以ep管中浑浊度表示，+++为严重浑浊、++为浑浊、+为轻微浑浊。以无菌生长的最高药

物稀释度(最低药物浓度)为提取液对试验菌的最低抑菌浓度。3结果与讨论

3.1提取工艺条件优化对提取率的影响

3.1.1标准曲线

按照2.3.1中方法测定最大吸收波长为506nm，于此波长下

分别测得槲皮素标准品各浓度的吸光度并绘制标准曲线，得回归

方程y=0.5486x+0.0245。其结果见图1。

图1黄酮的标准曲线

按照2.3.2中方法测定最大吸收波长为765nm，于此波长下

分别测得没食子酸标准品各浓度的吸光度并绘制标准曲线，得回

归方程y=9.5293x+0.0499，其结果见图2。