白蛋白胆红素结合耦合脂质体

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白蛋白

卵白蛋白包括卵清蛋白和伴清蛋白，主要从卵白中提取。乳白蛋白广泛存在于哺乳动物（牛、山羊、骆驼、马、荷兰猪和兔等）和人的乳汁中是由乳腺腺泡上皮合成的特殊蛋白质。麦清蛋白和豆白蛋白等统称为植物性白蛋白，从植物种子中提取。血清白蛋白主要来源于动物血液。
二、白蛋白的来源
பைடு நூலகம்
白蛋白的提取工艺
动植物组织或细胞，细菌细胞裂解破碎
色；碳原子-灰色。
重叠人血清白蛋白和人血清白蛋白-十四酸复合物的结构显示脂肪酸结合显著地
改变人血清白蛋白的构象。
为什么白蛋白可以作为许多药物的载体？
其机理何在？
①它是内源性物质，不会产生毒性或免疫反应。 ②同时具有良好的稳定性。 ③白蛋白独特的空间结构可增加难溶性药物在血浆中的溶解度，显著降低药物毒性，且对于易氧化药物具有较好的保护作用。
Ⅰ、化学键偶联：白蛋白具有很多活性氨基、羧基，应用白蛋白表面的活性基团与药物偶联，在体内酶的作用下
链接的化学键缓慢断裂，可以实现缓释、提高药物溶解性、靶向等目的。
以表面活性氨基可供结构修饰做较为详细的介绍：
ⅰ.共价偶联改变表面性质（如PEG修饰提高亲水性，避开巨噬细胞的吞噬） ⅱ.结合细胞特异性受体（如半乳糖化修饰提高肝靶向性） ⅲ.叶酸修饰（提高对叶酸受体丰富的肿瘤细胞的靶向性） ⅳ.免疫抗体欧联（抗体-抗原介导系统） ⅴ.磁性化等措施实现药物的主动靶向性。
• 优势：避免原药不良反应；快速靶向到靶点，起作用。
五、白蛋白作为药物载体的优缺点
• Fiehn等人通过胶原诱导关节炎（collageninducedarthritis，CIA）的小鼠模型研究了MTX与 MTX-HSA的疗效。结果表明，两者如要达到相同的疗效，MTX-HSA的给药量仅为MTX的 20%，且在治疗后期，仅MTX-HSA组显示有效。

白蛋白作为药物载体的特点

白蛋白的分类血清白蛋白
卵白蛋白
乳白蛋白
肌白蛋白
麦白蛋白
豆白蛋白
白蛋白（又称清蛋白）是由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为 15-19 天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的 40%-60% 。白蛋白是属于球蛋白的一种蛋白质。在人体内它最重要的作用是维持胶体渗透压。人血白蛋白，系由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取，并经病毒灭活处理制成。人血白蛋白制剂不含任何抗体，不会增加机体免疫力。
• （二）新型白蛋白纳米粒制备技术
• 不改变白蛋白结构的前提下，将药物载入其中，以提高制品稳定性。
• 例：紫杉醇- 白蛋白纳米粒( nab-paclitaxel， Abraxane®) 是第一个应用白蛋白纳米粒技术的上市药物，该制剂利用了肿瘤细胞摄取营养物质的途径，将白蛋白传送的营养物质替换为抗肿瘤药紫杉醇。 • A.避免了表面活性剂( 如聚氧乙烯蓖麻油) 的使用，减少了由此带来的过敏反应 • B.使药物富集于肿瘤病灶部位。 • （很多学者用nab-paclitaxel对部分癌症进行临床检验，从二期临床研究看来，紫杉醇-白蛋白纳米粒有：良好的药效且毒性可耐受，不良反应可控。）
（三）免疫抗体偶联 • 白蛋白纳米粒表面偶联抗体有助于实现其与肿瘤细胞的特异性结合，还能维持有效药物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度。 • 例：阚和平等人将抗人肝癌单克隆抗体HAb18 通过异型双功能交联剂与载多柔比星(ADR) 的人血清白蛋白纳米球[HSA(ADR) -NS] 偶联，制成的具有单抗活性的抗人肝癌免疫纳米球HAb18HSA(ADR) -NS能与人肝癌细胞株SMMC-7721 特异性结合，其体外杀伤SMMC-7721 细胞的IC50 值 (44.6 µg/ml) 较HSA(ADR)-NS(345.5 µg/ml) 及 ADR(365.5µg/ml)明显降低；人肝癌裸鼠模型显示肿瘤抑制率比HSA(ADR)-NS 及ADR 明显增强。

脂质体的研究进展学

新型药物载体免疫脂质体的研究进展 08药剂3班乔宇 20080702067免疫脂质体(immunoliposomes)是单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb，简称“单抗”)或其片段修饰的脂质体的简称，这种新型药物载体对靶细胞具有分子水平上的识别能力，具有很多优势，包括对肿瘤靶细胞呈现明显的选择性杀伤作用，且杀伤活性比游离药物、非特异抗体脂质体、单独单抗等更强；在荷瘤动物体内呈特异性分布，肿瘤病灶药物浓度升高，药物毒副作用较小；体内循环半衰期长及运载药物量大等。

免疫脂质体发展至今经历了数代：第一代是抗体或抗体片断直接与脂质体的脂膜相连，但由于巨噬细胞的吞噬很快被血液清除；第二代在第一代的表面引入了聚乙二醇(PEG)等亲水性大分子，延长了在血液中的循环时间，但PEG长链对单抗的屏蔽使抗体与靶细胞的结合能力降低；第三代将抗体连接在PEG或其衍生物的末端，制成空问稳定性免疫脂质体(sterically stabilized immunoliposomes，SIL)，延长了包含药物的脂质体的血液循环时问，且单抗伸展至脂质体外部发挥寻靶作用。

本文就免疫脂质体的分类、抗体连接脂质体的方法、临床应用及其发展现状进行综述。

1 免疫脂质体的分类根据靶向特异性细胞和器官的原理可将免疫脂质体分为抗体介导和受体介导两类。

1．1 抗体介导的免疫脂质体抗体介导的免疫脂质体是利用抗原一抗体特异性结合反应，将单抗与脂质体偶联。

抗体有单克隆抗体和多克隆抗体之分，单抗因其专一性在抗体应用中占主导地位。

现今，全世界已有超过1 50种单抗应用于临床或正处于临床研究阶段，且也已从原先的纯鼠单抗发展为人鼠嵌合抗体及人源化抗体，如已上市的人源化单抗Daclizumab、Palivizumab、Trastuzumab等；临床应用中，单抗从最初治疗器官移植排斥反应、降凝血发展到治疗癌症、HIV感染等疑难性疾病[2】。

1．1．1 两种抗体修饰的双靶向免疫脂质体靶向物用两种不同的抗体修饰脂质体，可增加其结合特异性和细胞摄取率，并且抗体在靶向细胞时能产生协同作用【3】。

我国研究发现帕金森病发作与三种蛋白质相关

我国研究发现：帕金森病发作与三种蛋白质相关2011年04月07日09:52 来源：健康报网黑龙江省大庆油田总医院神经内科解洪荣博士等研究人员在最近完成的一项关于帕金森病（PD）的研究中发现，可溶性抗药性相关钙结合蛋白、膜联蛋白V和核糖体蛋白P0这3个表达明显增加的蛋白质与帕金森病的发病有明显关联。

此项研究成果近期在意大利《神经科学》上发表。

解洪荣等通过在体外应用MPP+处理未分化的SH-SY5Y细胞，建立模拟人类帕金森病的细胞模型，采用荧光染色双向差异凝胶电泳、图像分析、基质—辅助激光解析/电离—飞行时间质谱和生物信息学的技术，在实验组和对照组之间发现了7个表达上调、15个表达下调共22个差异表达蛋白。

质谱成功鉴定出了其中3个蛋白质，分别为可溶性抗药性相关钙结合蛋白、核糖体蛋白P0（RPLP0）和膜联蛋白V。

研究结果提示，这3个表达明显增加的蛋白质可能在调节钙离子超载、启动DNA损伤修复和参与凋亡诱导等方面与PD相关，为进一步研究帕金森病的发病机制和治疗靶点的合理筛选提供了新的线索和理论依据。

经检索查新证实，可溶性抗药性相关钙结合蛋白等3个表达上调的蛋白质在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞PD实验模型中是首次被发现，而且核糖体蛋白P0在PD体外细胞模型中亦是第一次报道。

（记者衣晓峰通讯员李华妍）德国科学家查明一种家族性帕金森氏症致病机理2010年06月07日08:28 来源：新华网德国科学家近日报告说，他们查明了一种家族性帕金森氏症的致病机理，并发现了此病一种可能的治疗靶点。

２００３年科学家曾发现少数人的家族性帕金森氏症是由他们携带的ＤＪ－１基因变异引起的。

但是迄今科学界对ＤＪ－１了解并不多。

德意志研究联合会脑分子生理学研究中心科学家４日报告说，他们利用细胞内折叠酶生物传感器查明ＤＪ－１蛋白存在于健康细胞的细胞质溶质中，并以同型二聚体的形式存在。

所谓同型二聚体，即两个相同分子的形式与细胞膜和细胞器相关联。

漫谈免疫层析诊断试剂中的标记物之脂质体

漫谈免疫层析诊断试剂中的标记物十一脂质体脂质体是由磷脂分子在水相中自发形成的内为中空、外有双层磷脂分子的微球。

由于其内部可以包含荧光染料等物质，因此脂质体可以用做标记物并应用于免疫层析检测。

在免疫层析中使用的脂质体粒径一般为200-400nm，内含的染料一般为红色的硫氰酸盐。

优点：1．检测灵敏度高；与其它固体标记物相比，如胶体金、彩色微球等，只有其表面信号才能够被检测到，其内部信号则无法检测。

脂质体由于其中空的内囊可以容纳104-105个荧光染料(如粒径为200nm的脂质体内部可以包含3.2×105个硫氰酸盐分子)，且由于双层磷脂分子是透明的，光容易通过，因此在检测中，脂质体内部所能检测的信号要远远多于其它固体标记物表面的信号，这会大大提高检测灵敏度。

从理论上，采用胶体金标记，检测灵敏度在ng (10-9)级别，采用化学发光和荧光标记，检测灵敏度在pg(10-12)级别，而采用脂质体标记，检测灵敏度在fg (10-15)级别。

如检测E coli O157：H7，检测灵敏度为胶体金为 1.8 × 105 CFU/ml，脂质体为104 CFU/ml。

采用脂质体标记，检测肉毒杆菌毒素检测灵敏度为15 pg/mL，检测霍乱毒素检测灵敏度为10 fg/mL。

2．脂质体的表面化学基团可以衍生化，添加各种功能基团，以利于同各种分子，尤其是有利于核酸分子交联；这就有利于Oligochromatography试纸条的研制以检测DNA/RNA。

而采用胶体金标记，则需要将核酸分子巯基化，才能够通过配位键结合。

如采用脂质体标记核酸探针，制备Oligochromatography试纸条，检测隐孢子虫mRNA，可以1-5个活的孢子。

见图24。

3．脂质体的内部不仅可以包含染料分子，还可以包含、荧光物质、酶、底物、化学发光等等物质，这样就提供多种检测可能；如韩国学者将铕包含于脂质体中，将脂质体裂解释放铕后，通过测定铕的电化学发光信号从而达到对待测物的检测的目的。

脂质体(Liposomes - 浙江大学药学院

脂质体的种类与特点
类型多室脂质体小单室脂质体大单室脂质体 (REV) 优点缺点体内动态
包封容积大，包粒径大，不均匀，稳静脉给药后易被封率高，膜的性定性差；不易包封蛋网状内皮系统吞质与细胞膜相似白、核酸等大分子；噬向细胞内的输送困难。粒径大小、形态包封率和包封容积小，静脉给药后可达均匀易发生脂质体融合。到肝实质细胞，给药后血中的半衰期较长。可包封蛋白质、粒径大小不均匀核酸等物质，包封容积大，包封率高静脉给药后易被网状内皮系统吞噬，体内稳定性比多室脂质体差。

方法：pH梯度法制备： 1.以pH为4.0的枸橼酸缓冲液为水相，采用逆相蒸发法或薄膜分散法制备空白脂质体。 2.用1mol/L的氢氧化钠或碳酸氢钠调节上述空白脂质体悬液的pH为7.8。使脂质体膜内外形成H+梯度，内部为酸性（ pH4.0），外部为碱性（ pH7.8）。 3.将多柔比星用pH7.8的Hepes缓冲液溶解，60 ℃与空白脂质体悬液孵育10～15min，即得包封率高达90％以上的载药脂质体。
复乳法

将少量水相与较多量的磷脂油相进行乳化（第一次），形成W/O乳剂，减压除去部分有机溶剂（或不除去也可），然后加入较大的水相进行第二次乳化，形成W/O/W型复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得。复乳法得到的脂质体为非同心多囊结构，更适合包封水溶性药物，包封率高，并具有缓释效果。
复乳法制备举例——甲氨蝶呤脂质体
脂质体的研究热点
亲水性侧链具有空间稳定和长循环作用磷脂
包封的药物
嫁接的配体具有主动靶向功能

同时具有主动靶向和立体稳定的脂质体
磷

脂

紫杉醇脂质体白蛋白结合型

紫杉醇脂质体白蛋白结合型
紫杉醇是一种常用的抗癌药物，但由于其溶解度低和毒副作用大而受到限制。

脂质体是一种微小的脂质囊泡，可以包裹药物并提高其溶解度，同时白蛋白作为载体可以增加药物的循环时间和靶向性。

因此，将紫杉醇与脂质体和白蛋白结合在一起，可以有效地克服这些问题。

研究表明，紫杉醇脂质体白蛋白结合型具有更好的药物释放特性和更高的抗肿瘤活性，同时减少了毒副作用。

这种药物输送系统可以通过被动靶向和主动靶向的方式，将药物精确地输送到肿瘤组织，从而提高了药物的疗效。

此外，紫杉醇脂质体白蛋白结合型还可以通过改善药物的生物利用度，降低药物的毒性，提高患者的生活质量。

因此，这种新型的药物输送系统在临床上具有广阔的应用前景，有望成为未来癌症治疗的重要手段之一。

总之，紫杉醇脂质体白蛋白结合型作为一种新型的药物输送系统，具有较高的药物载荷能力、良好的靶向性和生物相容性，为癌症治疗带来了新的希望。

随着科学技术的不断进步，相信这种药物
输送系统将在未来发挥越来越重要的作用，为患者带来更好的治疗效果。

脂质体转染_实验报告

一、实验目的本实验旨在通过脂质体转染技术将目的基因导入细胞内，研究脂质体转染方法对基因表达的影响，为后续基因功能研究提供技术支持。

二、实验材料1. 细胞：人胚肾细胞HEK2932. 载体：pGL3-Basic（含有报告基因）3. 脂质体：Lipofectamine 30004. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液5. 实验仪器：超净工作台、CO2培养箱、酶标仪、显微镜、PCR仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞汇合至80%时进行实验。

2. 脂质体-DNA复合物制备：将pGL3-Basic质粒DNA和Lipofectamine 3000试剂按照说明书比例混合，室温孵育20分钟。

3. 细胞转染：将脂质体-DNA复合物加入细胞培养孔中，轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时。

4. 洗涤：弃去转染液，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。

5. 优化培养条件：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入脂质体-DNA复合物，对照组加入等量无DNA的脂质体。

6. 重组蛋白表达检测：收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot检测目的蛋白表达水平。

7. 报告基因表达检测：收集细胞，提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测报告基因表达水平。

四、实验结果1. Western blot结果：实验组细胞中目的蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染成功。

2. 实时荧光定量PCR结果：实验组细胞中报告基因表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染对基因表达有显著促进作用。

五、实验讨论1. 脂质体转染技术在基因研究中的应用：脂质体转染技术具有操作简便、转染效率高、安全性好等优点，是基因研究中最常用的转染方法之一。

2. 本实验中，脂质体转染成功地将目的基因导入细胞内，并显著提高了报告基因的表达水平。

这表明脂质体转染技术在本实验中具有良好的效果。

毛细管电泳应用于测定牛血清白蛋白与脂质体的相互作用

毛细管电泳应用于测定牛血清白蛋白与脂质体的相互作用厉红;屈锋;徐建栋;邓玉林【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2008(26)4【摘要】建立了一种用毛细管电泳法检测牛血清白蛋白(BSA)与脂质体相互作用的分析方法.氧化指数的测定实验结果表明经过冷冻干燥的脂质体稳定性更好;毛细管电泳表征脂质体的电荷性质实验结果表明脂质体在pH 5.0～8.0的条件下呈电中性.在pH 7.0的条件下,以各种浓度的脂质体混悬液为电泳缓冲液,以0.8%二甲亚砜(DMSO)为内标,随着缓冲液中脂质体质量浓度从0增加到2.4 mg/mL,BSA的有效淌度从-2.232×10-4 cm2·V－1·s－1变化到-3.046×10-4 cm2·V－1·s－1;结合Scatchard分析,测得BSA与脂质体的结合常数为2.522×103(g/mL)－1.该方法简单、快速,为研究蛋白质与脂质体的相互作用提供了新的技术手段.【总页数】5页(P473-477)【作者】厉红;屈锋;徐建栋;邓玉林【作者单位】北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081;北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081;北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081;北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.毛细管电泳前沿分析法及分子模拟辅助研究牛血清白蛋白与荧光素钠的相互作用[J], 姜萍;武利庆;热娜古力·嘎依提;李勤;胡晓明;戴荣继;耿利娜;邓玉林2.亲和毛细管电泳法和荧光法研究氟喹诺酮类药物与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 张黎伟;张新祥3.区段灌注毛细管电泳研究药物与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 郭宝元;夏之宁;陈国华;阴永光;徐红梅4.毛细管电泳法对盐酸维拉帕米与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 张剑;张博;唐一梅;匡元元;刘春叶5.毛细管电泳法研究牛血清白蛋白与盐酸异丙肾上腺素的相互作用 [J], 刘春叶;张雪娇;苗延青;赵灵芝;赵敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

脂质体与胆固醇

脂质体转染脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。

最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。

已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。

如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008Apr;1777(4):362-8)；如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 1989 Jan25;264(3):1508-15)；转染siRNA造成脱靶效应等等。

细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小，脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因。

这会对相关研究数据产生严重的干扰，甚至影响研究的结论。

这已引起了许多研究者的注意。

虽然人们早已发现脂质体对细胞的毒性，对研究的影响，但由于一直没有更好的方法尤其是更高效的转染方法代替脂质体，所以脂质体转染试剂一度应用非常广泛。

同时，人们也一直在寻找更有效、毒性小同时对研究影响也小的转染试剂。

由于脂质类转染试剂对细胞的毒性是由其脂质特性决定的，目前众多的研究者和生物公司将新一代转染试剂的开发聚焦在非脂质体的聚合物上，并已有一些优秀的试剂产品上市。

胆固醇在脂质体中的应用胆固醇可调节磷脂双分子层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏。

同时可使脂膜维持一定柔韧性，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力。

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白蛋白胆红素结合耦合脂质体:治疗黄疸的影响
摘要：
在本研究中，我们证明了脂质体的适宜性是一种作为去除高胆红素血症大鼠血浆胆红素的方法。

脂质体具有与胆红素结合的疏水相互作用的内在趋势。

不同类型的脂质体中，带正电荷的脂质体被发现对游离胆红素有最大的亲和力。

然而，包封或耦合的血清白蛋白对脂质体的表面可以使他们的胆红素的结合能力成倍增加。

脂质体能够优先结合胆红素是在红细胞的存在下。

有趣的是，这些脂质体，发现取代胆红素结合的红细胞的表面上一样。

本研究的结果进一步表明，白蛋白轴承脂质体去除实验，对于黄疸动物血浆胆红素同样有效。

这些观察表明，脂质体介导的选择性归巢，在治疗高胆红素血症的条件下，多余的血浆胆红素对对模型动物的肝细胞（参见肝细胞）可能有助于安全战略的发展。

原文
顺便说一句，胆红素具有高亲和力白蛋白，从而压迫或偶联白蛋白在脂质体的表面,会导致与胆红素结合若干倍的增加。

为了测试我们的假设，我们评估他们的脂质体结合的各种类型的自由以及血浆膜结合胆红素。

最后，我们确定这些脂质体是否将促进肝细胞摄取和矢量胆红素的转运。

在体内的研究表明，基于胆红素降低配方，不仅有助于脂质体复合物的形成也促进胆红素在模型动物的全身血液循环。

2。

材料和方法
2.1。

材料
蛋磷脂酰胆碱（卵PC）是从蛋黄中分离和纯化，如前所述。

胆固醇（CHOL）是从印度孟买原子核研究实验室购买，胆固醇结晶三次后用甲醇。

硬脂胺（SA），phophatidyl丝氨酸（PS），神经节苷脂，氰基硼氢化钠，游离脂肪酸的白蛋白（各种动物源）和胆红素均购自西格马。

高碘酸钠、乙二胺四乙酸（EDTA）是从印度孟买西斯科研究实验室购买。

Sephadex G-75和Sepharose 6B从Pharmacia精细化学品采购。

2.2。

方法
2.2.1。

胆红素溶液的制备
考虑到这一事实，市售的胆红素中污染杂质可能会干扰脂质体–胆红素结合研究和纯化后公布的程序。

再结晶的胆红素（5毫克）溶解在38mL的碳酸钠溶液含有1 mL EDTA 1毫升（pH11.0）。

该解决方案是以5000 rpm离心10分钟，除去不溶性胆红素。

胆红素的溶液的pH值和Tris缓冲生理盐水调整到8（10mL，150mL氯化钠，pH 7.6）。

在453nm下，用摩尔消光系数分光光度法测定胆红素的浓度6.2*10^4/M/cm。

胆红素溶液避光，防止光降解和在制备最低为30分钟。

所有的实验都进行了排除日光光源，使用覆盖双层橙色玻璃，在440 nm的发射非常少的照明。

2.2.2。

脂质体的制备
在本研究中，胆红素被允许在不同的物理化学性质的脂质体的相互作用。

各种类型的脂质体组合物如下：
中性脂质体：蛋PC和胆固醇（7:3摩尔比）
带负电荷的脂质体：蛋PC，胆固醇和PS（7∶2∶1摩尔比）
带正电荷的脂质体：蛋PC，胆固醇和SA（7∶2∶1摩尔比）
白蛋白耦合[人血清白蛋白（HSA）/ ]脂质体：蛋PC，胆固醇和神经节苷脂
白蛋白耦合/包埋（HSA /）脂质体：蛋PC，胆固醇和神经节苷脂（20:20:4摩尔比）单层脂质囊泡（ulvs）通过超声波方法以下公布的程序在我们的实验室制备的改性。

简单的，所需的脂质成分溶解在氯仿–甲醇的混合物在厚厚的玻璃管，和溶剂被缓慢的射流的N 2获得很薄的脂质膜管壁上下被移除。

溶剂的痕迹留在真空除去管中一夜。

这薄层是分散
在0.8毫升的硼酸盐缓冲液（10 mM硼酸，氯化钠60毫米，ph8.4）。

在4摄氏度氮气环境下，脂质超声探头的超声波发生器的分散为30分钟（脉冲模式，3秒的脉冲2 秒的间歇）。

在10000 rpm ，4摄氏度，用RC5C散热离心机超声处理制备的钛颗粒一小时，去除分散不良的脂质。

只有前三分之二的上清液进行进一步的研究。

这些脂质体的平均粒径，通过负染色电子显微镜测定，大概是60+/-10 nm。

2.2.3。

与脂质体血清白蛋白共价偶联
在脂质体包封的血清白蛋白冻融法–其次是耦合的白蛋白在脂质体表面的影响。

从各种来源的血清白蛋白共价连接到脂质体的表面，如前所述。

简要，脂质体进行的脂质体的表面上存在的神经节苷脂对产生式的醛基的高碘酸盐氧化。

随后，囊泡在1.5*15cm 高碘酸盐分离交联葡聚糖G-75column平衡在20 mL硼酸盐，氯化钠120mM（ph8.4）。

采用RC 3B冷却离心机（1500转，4摄氏度），脂质体的峰值集中在一个超过滤centriflo锥。

为了结合，氧化脂质体（10微摩尔每一毫升）进行混合，在0.5毫升的20 mM硼酸盐给定的血清白蛋白10毫克,120mM的盐水（ph8.4）。

上述混合物中加入15微升的NaBH 3 CN（2M）和反应混合物在室温下放置14小时。

非耦合的白蛋白通过该混合物1.6*90cm的琼脂糖6B柱去除，与蔗糖平衡补充三盐水（10mMTris，44mM蔗糖，氯化钠120mM和5mMEDTA，pH 7.4）及白蛋白偶联脂质体中的空隙体积洗脱。

对应于囊泡的峰又名马苏德。

生物化学与生物物理学报1564 /周期等（2002）219 226 220–集中使用centriflo锥如上。

蛋白质在HSA /脂比脂质体80微克每微摩尔脂质PI，而这是对HSA /脂质体的脂质PI 96微克每微摩尔，用BCA 试剂法估计。

2.2.4。

体外胆红素结合到脂质体
37摄氏度下，胆红素溶液在各种脂质体制剂中，测定脂质体的胆红素结合动力学。

在浓度，以及时间依赖的方式研究了相互作用。

简单地说，在37摄氏度Tris缓冲液（10 mM Tris，150mM盐水，pH 8。

）中，脂质体（62.5 —500 nmol 脂质Pi/500微升）用500微升2:1胆红素/白蛋白混合物孵育（总胆红素150 微摩尔）1 h 。

未结合胆红素在1.5*30cm的交联葡聚糖G-75柱平衡三10mM,150mM的NaCl溶液（pH 8）。

采用RC 3B冷却离心机（1500转，4摄氏度），脂质体的峰值集中在一个超过滤centriflo锥。

我们还确定胆红素在脂质体的存在下，分离的红细胞和全血的结合。

简要地说，在人类红细胞的存在（1*10^8个细胞）下，37 条件下，脂质体（250nmol脂质PI）是以2:1的胆红素/白蛋白孵育混合（总胆红素150微摩尔）1 小时，保持反应混合物的1毫升的最终体积的Tris缓冲生理盐水。

通过孵化脂质体已经饱和的胆红素的红细胞，研究了胆红素与脂质体与红细胞表面相对相互作用。

简单地说，胆红素饱和红细胞（1 *10^8 细胞胚胎）孵育与各种脂质体制剂（250 nmol 脂质Pi) 1 小时在37 摄氏度条件下，保持最终体积1 mL，用Tris缓冲液。

脂质体进行分离，在4摄氏度2000转下，离心10分钟，脂质体结合胆红素估计为前面描述的。

同样地，红细胞的潜力，以取代脂质体绑定胆红素被研究通过允许他们与胆红素饱和脂质体进行交互。

简单地说，250 nmol 脂质Pi 被允许与红细胞交互（1*10^8 细胞一小时在37摄氏度下。

在2000 rpm 4摄氏度下，使用RC 3B 离心机离心30 分钟，分离红细胞和脂质体。

在2000转离心4摄氏度下，分离10分钟进一步清洗。

脂质体以及红细胞分析其胆红素含量在公布的程序。

2.2.5。

在脂质体的体外细胞毒性试验
采用MTT微培养四氮唑法使用公布的程序[ 20 ]测定了不同的脂质体制剂的毒性。

简要地说，人类胚胎肾（HEK）在指数生长的细胞期收获和离心分离5分钟在2000*克，完全悬浮在培养基。

在37摄氏度，细胞在96孔板中的分配（180微升DMEM中有2*10^4个细胞）和在孵育5%加湿的CO 2孵化器。

24小时后，20微升脂质体溶液在六个重复的说给0–2000纳米脂质体（脂质PI）终浓度为每毫升。

在37摄氏度培养48 h后，20微升的MTT（原液
5毫克/毫升PBS）被添加和板再培养4 h后，介质通过抽吸除去。

二甲基亚砜（150 Al）被添加到每口井，并结合被溶化的轻轻摇动。

板块在540nm微孔板阅读器被立即阅读（Ceres uv900c，生物科技仪器，美国）。

威尔斯用完全培养基，脂质体法和MTT法，但没有细胞，作为空白。

硫酸长春新碱（40 nm）是能够诱导100%杀死的细胞和作为阳性对照。

2.2.6.体内相互作用的脂质体与梗阻性黄疸大鼠血浆胆红素水平
雄性Wistar 大白鼠被曝光使用，三个候补天内制定出高胆红素血症足月条件胆红素/大鼠血清白蛋白（RSA）（摩尔比2：1）解决方案。

每一种动物收到 1 毫升的胆红素/RSA 解决方案对应75 uM 胆红素每剂量；前两个剂量均由皮下路线，紧接着最后静脉注射的相同数量的胆红素（75 uM 1 毫升等渗缓冲区中）管理。

动物分为六个不同的小组；每个由包含10 动物。

1.正常大鼠不给予任何治疗
2.高胆红素血症大鼠给予没有脂质体治疗
3。

高胆红素血症大鼠给予自由的RSA处理
4.高胆红素血症鼠给予PC脂质体治疗。