蛋白质相互作用多种方法-chandre
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蛋白质间相互作用研究的方法和技术
蛋白质间相互作用研究的方法和技术蛋白质是生命体中最重要的分子之一，它们在细胞内扮演着各种重要的生物学角色，包括信号传导、结构支撑、运输和催化等。
蛋白质的功能主要通过它们的结构和相互作用来实现。
因此，了解蛋白质间相互作用的研究方法和技术对于理解生命体系中的复杂过程至关重要。
蛋白质-蛋白质相互作用的类型和标准方法蛋白质间相互作用可以大致分为两类：非共价相互作用和共价相互作用。
前者包括氢键、疏水作用、离子键等；后者主要包括二硫键。
了解这些不同种类的相互作用的方式，是了解蛋白质结构和功能的基础。
因此，研究这些相互作用的方法和技术是非常必要的。
在研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法中，目前最常用的方法是表面等离子体共振（SPR）和交联质谱（XL-MS）技术。
SPR技术基于蛋白质与配体之间的结合，可以实时监测蛋白质-蛋白质复合物的形成。
该技术通过测量蛋白质与配体之间的反应率来确定它们之间的结合强度和动力学参数。
与SPR技术相比，XL-MS技术更加直接和精确。
该技术通过将蛋白质交联，然后将其裂解并用于质谱分析来确定相互作用的位点和强度。
与其他方法相比，这种方法有一个很大的优点，即不需要事先知道被测蛋白质之间的相互作用通路，因为它可以同时检测多种相互作用。
细胞表面展示技术的应用细胞表面展示技术是一种新兴的技术，它允许将蛋白质展示在细胞表面上，从而实现了高通量筛选和发现新的蛋白质-蛋白质相互作用。
这个技术实现方式可以通过基因工程手段，将目标蛋白质的一个表面区域作为 "派对 "的地方，展示在基因改造的细胞表面上，从而诱使其他蛋白质与它相互作用。
通过这种方式，可以在筛选大规模基因库或鉴定蛋白质并行结构时有效地发掘新的蛋白质-蛋白质相互作用。
结论在生命体系中，蛋白质-蛋白质相互作用是如何实现功能的重要机制。
研究蛋白质间相互作用的方法和技术不仅有助于我们理解生命体系中动态和复杂的过程，还有助于我们发现新的药物和治疗方法。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
蛋白质相互作用多种方法共73张
蛋白质相互作用多种方法共73张蛋白质是生物体内最重要的功能性分子之一，它们在细胞的结构和功能调控中起着至关重要的作用。
蛋白质相互作用是维持细胞内平衡和调控生命过程的关键。
而为了研究蛋白质相互作用，科学家们发展了许多方法和技术。
下面将介绍几种常用的蛋白质相互作用研究方法。
一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种高通量的蛋白质相互作用筛选技术，它基于酵母菌的两个部分蛋白质结合时能够引发基因转录的特性。
该方法需要构建两个表达融合蛋白质的酵母菌株，其中一个融合蛋白质与待测蛋白质进行相互作用后，会激活转录因子从而促进报告基因的表达。
通过筛选和鉴定这些报告基因的表达水平，可以确定两个蛋白质之间的相互作用关系。
二、质谱法质谱法是一种通过分析蛋白质质量和结构的方法，也可以用于研究蛋白质的相互作用。
质谱法包括两种主要的方法：质谱法和质谱质谱法。
质谱法通过测量蛋白质的尺寸、质量和电荷等物理化学特性来揭示蛋白质之间的相互作用。
而质谱质谱法则通过分析蛋白质片段的质谱图谱，鉴定蛋白质之间的相互作用位点和结构。
三、表面等离子体共振表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）是一种实时检测蛋白质相互作用的光学技术。
该方法通过测量光的折射率来监测蛋白质的结合和解离。
SPR技术通常使用金属表面修饰的芯片，其中一个蛋白质被固定在芯片表面，另一个待测蛋白质则溶解在流动的缓冲液中。
当两个蛋白质结合时，会导致光的折射率发生变化，从而可以实时监测到蛋白质的相互作用过程。
四、荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种基于蛋白质间染料荧光信号的技术。
该方法需要在待测蛋白质上标记一对荧光染料，其中一个染料作为接受者，另一个染料作为给体。
当这两个染料的发射和吸收频率相互匹配时，能量可以通过非辐射损失的方式从给体跃迁到接受者，从而引发接受者的荧光信号。
研究蛋白质相互作用的方法
研究蛋白质相互作用的方法
1. 酵母双杂交呀，这就像是给蛋白质牵红线，看它们能不能对上眼！比如说，我们研究那两个蛋白质，就把它们分别放到酵母里，看它们能不能相互吸引，哇，真的很神奇呢！
2. 免疫共沉淀那也是超厉害的哦！就像是从大部队里精准地捞出我们想要的那两个蛋白质小伙伴。
就像研究细胞里的那两个关键蛋白，通过这个方法把它们一块儿抓出来，看看它们的关系，你说有趣不有趣呀！
3. 亲和层析呀，不就是设个专门的陷阱让目标蛋白质掉进去嘛！举个例子，我们要找那个特定的蛋白质，就设计个跟它特别契合的柱子，让它乖乖进去，然后就能研究它啦，是不是超棒呀！
4. 荧光共振能量转移，哇塞，这简直就是在蛋白质之间观察神秘的能量传递呀！比如说观察那两个发着光的蛋白质，看它们之间能量怎么流动，那感觉真的太奇妙啦！
5. 表面等离子体共振呢，就像是给蛋白质的互动建了一个超级敏感的检测站呀！比如研究那两个蛋白结合的过程，细微的变化都能察觉到，牛不牛啊！
6. 噬菌体展示技术也很有意思呢，就像是让蛋白质在噬菌体这个舞台上展示自己。
比如我们想找和某个分子结合的蛋白质，通过噬菌体就能把它们找出来，多神奇呀！
7. 蛋白质微阵列，这不就是把一堆蛋白质摆出来让人一目了然嘛！像我们把各种蛋白质放在那上面，然后就能快速了解它们之间的关系啦，酷不酷！
8. 生物膜干涉技术呀，就像是在蛋白质的世界里放了一个精准的测量仪。
例如我们想知道那两个蛋白质结合的实时情况，用这个技术就能清楚看到，你说厉害不厉害！
我觉得这些方法各有各的独特之处，都为我们深入研究蛋白质相互作用提供了强大的工具，让我们能更好地理解蛋白质的奥秘！。
蛋白质的四种相互作用
蛋白质的四种相互作用蛋白质是生物体内最重要的大分子有机化合物之一，它在维持生命活动和调节生物体各种功能上起着重要的作用。
蛋白质的功能与其结构密切相关，而蛋白质的结构主要由其内部的四种相互作用所决定。
这四种相互作用分别是氢键、离子键、范德华力和疏水作用。
氢键是蛋白质中最重要的相互作用之一。
氢键是指氢原子与电负性较高的原子间的作用力。
在蛋白质中，氢键主要是由蛋白质中的氨基酸残基之间的氢键形成的。
例如，蛋白质中的α-螺旋结构中，氢键起到了稳定螺旋结构的作用。
此外，在蛋白质的折叠过程中，氢键也起到了重要的作用，帮助蛋白质折叠成特定的三维结构。
离子键也是蛋白质中常见的相互作用之一。
离子键是指正负电荷之间的相互作用力。
在蛋白质中，离子键主要是由蛋白质中的氨基酸残基之间的氨基和羧基之间的电荷相互作用形成的。
离子键的形成可以增强蛋白质的稳定性，同时也可以在蛋白质的功能中发挥重要作用。
例如，蛋白质中的酶类分子通常通过离子键与底物结合，从而发挥催化作用。
第三，范德华力是蛋白质中相互作用的另一种重要形式。
范德华力是指分子之间由于电子云的运动而产生的瞬时偶极子，从而形成的吸引力。
在蛋白质中，范德华力主要是由蛋白质中的非极性残基之间的相互作用形成的。
范德华力在蛋白质的折叠和稳定过程中起到了重要的作用。
此外，范德华力也可以在蛋白质与其他分子之间的相互作用中发挥重要作用，例如蛋白质与配体的结合。
疏水作用也是蛋白质中重要的相互作用之一。
疏水作用是指非极性物质在水中聚集形成的力。
在蛋白质中，疏水作用主要是由蛋白质中的非极性残基在水中形成疏水核心，从而使蛋白质分子折叠成特定的三维结构。
疏水作用在蛋白质的折叠和稳定中起到了重要的作用。
此外，疏水作用也可以在蛋白质与其他分子之间的相互作用中发挥重要作用，例如蛋白质与膜脂质的相互作用。
蛋白质的四种相互作用，即氢键、离子键、范德华力和疏水作用，是蛋白质结构和功能的重要基础。
这些相互作用在蛋白质的折叠、稳定和功能中起到了重要的作用。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
研究蛋白质的相互作用的方法
研究蛋白质的相互作用的方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。
文献分享 蛋白之间的相互作用的检测方法
蛋白质是细胞生命活动的重要组成部分，它们通过相互作用形成复杂的信号传导网络，调控细胞内外的生物学过程。
研究蛋白质之间的相互作用对于理解生物学功能具有重要意义。
随着科学技术的不断发展，人们提出了许多方法来检测蛋白质之间的相互作用。
本文将介绍几种常用的蛋白质相互作用检测方法，希望能对广大科研工作者提供一些参考。
一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种常用的蛋白质相互作用检测方法。
其基本原理是将待测蛋白与转录因子的DNA结合结构域融合，构建成自激活基因的表达体系，并将该体系转化到毕赤酵母中。
利用这种方法可以鉴定出与待测蛋白相互作用的蛋白质。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是利用微阵列技术将大量的蛋白质固定在载玻片上，然后与待测蛋白进行相互作用，再通过荧光染色或其他方法来检测蛋白质间的相互作用情况。
该技术具有高通量、高灵敏度和快速的特点，适用于大规模蛋白质相互作用的筛选。
三、质谱技术质谱技术是一种通过测定待测蛋白的质量和结构来研究蛋白质相互作用的方法。
常用的质谱技术包括表面增强拉曼光谱（SERS）和质谱成像等。
通过这些技术可以直接观察到蛋白质之间的相互作用情况，从而揭示蛋白质相互作用的机制。
四、结合免疫沉淀和免疫印迹技术结合免疫沉淀和免疫印迹技术是一种通过蛋白质抗体特异性识别技术，通过特异性识别待测蛋白质与其相互作用的靶蛋白质。
其基本原理是将待测蛋白质进行免疫沉淀，然后用抗体进行免疫印迹检测。
该方法具有较高的特异性和灵敏度，适用于研究蛋白质间的相互作用。
五、荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术是一种利用两种荧光蛋白之间的能量转移来研究蛋白质相互作用的方法。
其原理是将一个荧光蛋白作为供体，另一个荧光蛋白作为受体，当它们之间的距离在合适的范围内时，能够发生能量转移。
通过测定其荧光的增强或减弱来确定蛋白质的相互作用情况。
通过上述介绍，我们可以看出，蛋白质之间的相互作用检测方法有多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
有多种方法可以检验蛋白质与蛋白质相互作用：
1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）：通过抗体选择性地沉淀出蛋白质复合物，并利用Western blot等技术检测相互作用蛋白质的存在。
2. 蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography）：将一个蛋白质固定于树脂上，然后通过蛋白质与其交互作用的其他蛋白质在层析柱中保留，并通过洗脱和分析来确认相互作用。
3. 光敏交联（photocrosslinking）：通过使用光敏交联剂，使两个相互作用的蛋白质发生共价化学反应，并通过分子量分析等技术来确定相互作用。
4. 双杂交实验（yeast two-hybrid assay）：利用酵母中的转录激活子结构域和DNA结合结构域的解偶联来检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5. 表面等离子共振（surface plasmon resonance）：利用传感器芯片上吸附的一个蛋白质通过流动相与另一个相互作用蛋白质进行实时监测，并测定其结合亲和力和动力学参数。
这些方法都能有效地检验蛋白质与蛋白质相互作用，具体选择哪一种方法还需根据实验目的和条件来决定。
蛋白质的相互作用研究方法
蛋白质的相互作用研究方法
蛋白质的相互作用研究方法可以分为以下几种：
1. 蛋白质互作筛选方法：包括酵母双杂交、蛋白质片段互作筛选、蛋白质互作文库筛选等。
这些方法通过检测蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，从而发现可能存在的相互作用蛋白质对。
2. 免疫共沉淀(IP)：通过特定抗体与目标蛋白质发生反应，将其与其他相互作用蛋白质一起沉淀下来，然后通过质谱分析等技术鉴定这些共沉淀蛋白质的身份。
3. 荧光共振能量转移(FRET)：通过标记在两个相互作用蛋白质上的荧光分子（供体和受体）之间的能量转移来检测蛋白质相互作用。
当供体与受体之间的距离在10-100埃范围内时，能量转移效率会增加。
4. 利用带电荷的染料分析：通过交联反应将具有不同电荷的染料引入到相互作用的蛋白质上，然后通过凝胶电泳或质谱分析等技术来鉴定交联蛋白质对。
5. 表面等离子体共振(SPR)：利用表面等离子体共振仪器，将一种蛋白质固定在芯片上，然后将另一种蛋白质溶液通过芯片，通过检测光信号的变化来确定是否存在相互作用。
6. 核磁共振(NMR)：利用蛋白质溶液中的核磁共振现象，鉴定蛋白质的三维结
构以及与其他蛋白质之间的相互作用。
以上是常见的蛋白质相互作用研究方法，不同的方法适用于不同的实验需求和研究目的。
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
噬菌体展示技术最关键的优势有三：
第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌 体成为可能； 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到 富集； 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接， 使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便.
适用于：研究蛋白质复合体中多个蛋白质间的相互作用，特别适用于 研究蛋白质在生理条件下的相互作用
原理方法
首先通过基因工程给被 分离纯化蛋白的一端加一 个TAP标签，该标签由 IgG结合结构域 (ProtA)及 一个钙调蛋白结合多肽 (CBP)组成，结构域与多 肽之间由一个TEV蛋白酶 切位点隔开。
然后通过基因重组将细胞内源 性的目标蛋白基因置换为带有TAP 标签的基因，温和裂解细胞，获取 细胞抽提物。 将抽提物加入IgG亲和柱，TAP 标签的ProtA端会与IgG形成强结合， 在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性 结合物和杂蛋白。 再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将 蛋白质复合体切割下来。在钙离子 参与下，被切割下来带有CBP的蛋 白质复合体与钙调蛋白紧密结合， 充分洗脱，就可以进一步去除非特 异作用的蛋白质杂质，最后纯化出 高纯度的目的蛋白复合体。
免疫共沉淀
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白 质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫 沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。蛋白质Y的 沉淀是基于与蛋白质X的物理性相互作用，称为免疫共沉淀。
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 A
B
Y
B Y Y A
2、假阳性是酵母双杂交系统的最大问题，假阳性通常由以下原因造 成： 1）prey蛋白的非特异性结合 2）无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数 假阳性的诱因）
假阳性的去除
• 通过序列分析去除 • 质粒消除实验剔除假阳性 • 重新转化含有诱饵质粒的酵母株或不含诱饵质粒的酵母株， 分析两种情况后去除假阳性 • 利用一个不相关的蛋白作为诱饵蛋白测试相互作用 • 两步或多步筛选
酵母双杂交的优点
双杂交系统的另一个构成部分是报道株。报道株指经改造的、含报道 基因的重组质粒的细胞。目前，大多采用的是酵母细胞具有以下优点: 1、快速获得相互作用蛋白的基因 2、只需单一步骤的质粒构建 3、 检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4、 作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省 去了纯化蛋白质的繁琐步骤 5、 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间 的微弱的或暂时的相互作用。 6、 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官不同亚细胞部位及 功能的蛋白。 7、 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X—Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感
序列分析
• 从酵母中分离质粒然后转化E.coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
报告基因
• LacZ reporter - Blue/White Screening • HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) • LEU2 reporter - Screen on Leu+ media • ADE2 reporter - Screen on Ade+ media • URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA)
酵母双杂交
1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母的 生长转录因子GAL4含有的两个结构域,DNA结合域(DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD),将已知基因(诱饵 基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上, 将这两种质粒共同转化酵母感受态细胞,若BD结合 时,则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近,呈现GAL4转录因子的完 全活性,启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达,从而在特定 的缺陷培养基上生长。
串联亲和纯化（TAP）
近年来质谱技术发展迅速，其功能强大且灵敏度高，常用来鉴定 相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基 ，但通常难以获得足够量纯化 的蛋白质复合体，成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。1999年 Rigaut （德国）等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法—串联亲 和纯化(Tandem affinity puri—fication，TAP)，兼具标准亲和纯化（可 以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体）和免疫共沉淀（用于特异性 的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用）两种生化方法的优点，为蛋白 质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。
主要用于：
两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用； 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。
注意：
1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变。因为出现假阳 性的概率比较高。 2 设置的对照：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞 系作为阴性对照等等。
缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥 梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选 择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身 具有冒险性，灵敏度不如亲和色谱高。
实 验的关键
1、 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也 不同，特别是多抗的特异性是问题。 2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制 剂，低温下进行实验。 3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不 能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原， 过多则抗原被稀释。
为了更好地理解细胞的生物学活性，必须 很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就 会涉及到蛋白质相互作用的研究。因此，揭示 蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关 系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点, 也是后基因时代的难题所在。研究蛋白质相互 作用的方法也就具有更为重要的意义。
蛋白质相互作用网络图
质粒构建
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面 的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒 • 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因， Leu2, Ura3, or Trp1等。
在实际应用中的局限性
1、 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，不能检测定 位于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白，而且融 合表达可能会影响目的蛋白修饰和折叠，尤其在研究异源蛋白相 互作用时，蛋白不一定能正确修饰和折叠，从而影响蛋白的活性 ，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键 形成等,这些反应在细胞核内无法进行。
GST-Pull down Assay
右：对照，中间翻 转混合时发生相互 作用，胶上只于 GST融合蛋白结合 而不与GST结合的 特异性条带表示新 的相互作用蛋白。
检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用常用的三种方法(Far western) ： 1、放射性标记融合蛋白 2、抗GST抗体检测 3、生物素标记融合蛋白
LacZ
Gal4激活域 Y Gal4激活域 Y X LacZ4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱 饵质粒。 2、将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母能筛选相互作用的蛋白。
优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； 3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
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噬菌体展示
噬菌体展示技术是在深刻理解f1和M13噬菌体遗传学和生理学特 性的基础上产生的。在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成的 融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保 持相对独立的空间结构和生物学活性。
1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合 蛋白,从次GST融合蛋白在研究蛋白质相互作用领域得到极大推广(His 也常用)。 原理：把要研究的目的蛋白基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载 体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探 针)挂到带有GST底物的Sepharose beads上，然后把另一种含目的蛋 白质Y的溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合 蛋白，如发生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集下来，后 续用过量游离的谷胱甘肽洗脱非特异结合的蛋白或采用SDS-PAGE鉴 定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质（类似于抗体检测蛋白质的技术）。 此方法常用来验证酵母双杂交试验所得到的相互作用。且只用于 确定体外的相互作用，还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀加 以证实。
蛋白质相互作用研究方法
姓名： 导师： 专业：
蛋白质相关知识及研究蛋白 质相互作用的必要性
有一些蛋白质可以以பைடு நூலகம்体的形 式发挥作用，但是大部分的蛋 白质都是和伴侣分子或是与其 他蛋白质一起发挥作用的。
人类蛋白质组相用
基因组计划--大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序 列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产 物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体 现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与 生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是 细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过 其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这 个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多 生物学活性。