蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研究

蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研究摘要：运用多重实时PCR对多地的养殖和野生蛙类携带虹彩病毒的本底展开调查，并进行病毒分型。

结果表明，检测的样品平均阳性率为8.90%，养殖蛙的平均阳性率为4.57%，野生蛙的平均阳性率为16.82%。

从蛙种类来看，养殖牛蛙和黑斑蛙带毒率较低，而养殖的棘胸蛙和野外捕捉的斑腿树蛙带毒率较高。

不同蛙携带的蛙病毒的分子序列比较结果显示，不同来源的蛙病毒高度保守，缺乏明显的宿主与地域特异性，表明人工繁育场暴发虹彩病毒可能对其他野生蛙类资源产生了负面影响，建议在野生动物人工驯养繁殖体系中引入病害监测和疫病防控措施。

关键词：蛙；虹彩病毒；多重实时PCR；流行病学中图分类号：Q959.5+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）09-1702-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.09.025Study on Molecular Epidemiology of Iridoviruses in RanaSHAO Jun-hui1，ZHANG Li-feng2，WANG Shu-yun2，LI Cong1，LUO Yang-zhi1，CHEN Xiao-xuan1，YUAN Jun-fa1 （1. College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2. Inspection andQuarantine Technical Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）Abstract：The multiplex real-time PCR assay was used to investigate the prevalence of iridoviruses in farmed or wild frog. Results indicated that the average positive rate was 8.90%，in which the average positive rate in farmed and wild frog was4.57% and 16.82%，respectively. The most significant prevalence of iridoviruses was found among the farmed Quasipaa spinosa and Polypedates megacephalus，while the species of Rana catesbeiana and Rana nigromaculata rarely. Sequences alignement of major capsid protein suggested that there were no obvious host and geographic specificity among these detected Rana iridoviruses，it indicated that the outburst of iridoviruses in farm produced negative effects on wild frogs，disease monitoring，disease prevention and control measures were proposed to introduce into the artificial domestication propagation system of wild animal.Key words：Rana；iridoviruses；multiplex real-time PCR；epidemiology近50年?恚?全球范围内多种两栖动物种群显著衰退，一些种类已经灭绝，部分物种濒危，原因包括气候变化、栖息地减少、环境污染以及疾病传播等[1，2]。

其中蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）和虹彩病毒（Iridoviruses）是引起两栖类种群数量下降的主要病原因素[3-5]。

中国部分蛙种的资源量也因环境变化以及人为捕捉等因素急剧减少。

如虎纹蛙（Hoplobatrachus ruguosus）、林蛙（Rana dybowskii）、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）等种类因肉味鲜美、营养丰富遭到过度捕捉，导致这些蛙类野生资源量急剧减少[6，7]。

近年来，为保护自然资源及满足市场需求，人们开展了多个蛙种的驯养及人工增养殖[8-10]。

但人工增养殖的模式对野生蛙类资源以及当地自然生态环境的影响缺乏系统的评估，尤其是人工增养殖中虹彩病毒病的暴发对野生资源的影响缺乏深入研究。

虹彩病毒无囊膜，对环境适应力较强，可在土壤和水体中存活长达几个月而保持感染性[11]。

为适应蛙的特殊生活习性，养殖场多位于较偏僻的山林地区，与周边环境存在许多交互作用。

当蛙养殖场暴发虹彩病毒病后，养殖用水的不规范处理、蛙的逃逸以及带毒蛙的商业流动等对当地野生蛙类资源的影响亟需评估。

先前，湖北省宜昌市某养殖场发生棘胸蛙的暴发性死亡，经鉴定为蛙病毒的感染所致[12]，但其病毒来源以及蛙携带病毒的本底等基础问题尚未知。

为此，本研究利用建立的蛙病毒多重检测方法[13]，对不同来源的养殖和野生蛙类携带虹彩病毒进行初步调查，并进行病毒分型研究，以期为优化人工增养殖的蛙类资源保护模式提供参考。

1 材料与方法1.1 样品采集样品详细采样情况见表1。

采集的蛙经麻醉后取脾或肾用于后续的检测。

1.2 样品DNA提取与筛查组织DNA的提取采用康为世纪通用型柱式基因组提取试剂盒，取不超过0.1 g组织，按试剂盒说明书进行，组织DNA以50 μL的三蒸馏水洗脱，-20 ℃保存。

以优化的三重荧光PCR方法筛查[13]。

优化的三重荧光PCR反应体系（25 μL）如下：5 μL DNA模板，10×recreation buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，通用正向引物（20 μmol/L）1 μL，通用反向引物（20 μmol/L）1 μL，探针1（20 μmol/L）0.5 μL，探针2（20 μmol/L）0.5 μL，探针3（20 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，用去离子水补足至总体积25 μL。

采用Roche Light Cycler 480Ⅱ荧光PCR检测仪：第一阶段：95 ℃3 min；第二阶段：95 ℃15 s，54 ℃15 s，60 ℃30 s，40个循环；60 ℃延伸时收集荧光。

扩增结果以在相应的检测通道呈典型的“S”型扩增曲线及Ct值判定。

1.3 基因扩增与克隆以蛙病毒保守引物RGVP1/P2（5’-GACTTGGCCACTTATGAC-3’/5’-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3’）?U增“1.2”中准备的部分样品DNA，扩增循环条件为95 ℃30 s，50 ℃45 s，72 ℃30 s，35个循环，预期扩增片段为531 bp，预期目的条带经胶回收后直接测序验证。

以NCBI登陆的蛙病毒主要结构蛋白（major capsid protein，MCP）序列设计引物MCPF1/R1（5’-ATGTCTTCTGTAACCGGTTCAG-3’/5’-TTACAAGA TTGGGAATCCCATCG-3’），用于扩增蛙病毒的MCP全长，扩增循环条件为95 ℃30 s，50 ℃45 s，72 ℃90 s，30个循环，预期扩增片段为1 392 bp。

扩增产物经胶回收后连接至T-easy载体，每个基因选择3个阳性克隆子测序。

1.4 序列分析以DNAstar进行常规的序列拼接与编辑，序列比对以Clustal 2.0软件进行，聚类分析以MEGA 6.0进行，以邻接法构建进化树，选择成对缺失模式，以bootstrip值进行验证，进化树以Treeview进行编辑。

2 结果与分析2.1 样品筛查结果先前建立的三重荧光定量PCR可检测不同种类的蛙病毒，其中探针1可检测包含蛙病毒3型（Frog virus 3，FV3）、饰纹汀蛙虹彩病毒（Bohel iridovirus，BIV）、流行性造血器官坏死症病毒（Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus，EHNV）、欧洲?t鱼病毒（European catfish iridovirus，ECV）、欧鲶病毒（European sheetfish iridovirus，ESV）、中华鳖虹彩病毒（Soft-shelled Turtle iridovirus，STIV）、大鲵虹彩病毒（Andrias davidiamus iridovirus，ADIV）、沼泽绿牛蛙虹彩病毒（Rana grylio virus，RGV）、虎纹蛙病毒（Tiger frog virus，TFV）等的蛙病毒，探针2可检测大口黑鲈虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV）、裂唇鱼病毒（Doctor fish virus，DFV）和孔雀鱼病毒（Guppyfish iridovirus，GV6），探针3可检测新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）[13]。

样品筛查结果（表2）显示，探针1检测的阳性率为8.90%，从养殖的219份蛙样品中检出10份阳性，平均Ct值为26.45，最小Ct值为20.03。

从野外捕捉的107份蛙样品中检出19份阳性，平均Ct值为28.18，最小Ct值为22.97。

从蛙种类来看，牛蛙和黑斑蛙带毒率较低，而野外捕捉的斑腿树蛙带毒率较高。

探针2和3均未检出阳性。

2.2 不同来源蛙携带病毒的比较因探针1可检测多种蛙病毒，为确定检测到的蛙病毒属于哪一种，进一步以蛙病毒MCP保守引物进行扩增，扩增片段为531 bp，并进行测序。

Blast比对结果（图1）显示，获得的MCP部分序列高度保守，同Rana grylio virus 9807高度保守，仅养殖来源的棘胸蛙（QSV46）同其他序列相差一个碱基，并导致一个氨基酸的差异。

为比较上述不同来源的蛙病毒的差异，设计引物扩增养殖的棘胸蛙来源（QSV46）与斑腿树蛙（PMV69）携带病毒的MCP全长。