环境工程微生物学综合实验- 功能菌（絮凝菌）的分离、筛选与性能研究实验须知*一、环境工程微生物学实验目的1. 通过实验进一步加深理解课堂讲授的理论内容。
2. 训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，建立无菌概念并掌握无菌操作技术。
通过实验，培养学生分析问题、解决问题的能力及创新能力，提高学生的综合素质，为将来能够独立工作打下坚实的基础。
二、环境工程微生物学实验基本要求1. 每次实验前必须对实验内容进行充分预习，弄清实验目的、原理及操作步骤，以免手忙脚乱，影响实验课效果。
2. 实验前，按内容要求仔细检查所需仪器、药品是否齐全，若有问题及时提出。
3. 整个实验过程要严格按操作步骤进行，不得马马糊糊，否则会造成错误，甚至出现事故。
4. 实验过程中要做好记录，特别是对于连续观察的实验，必须认真记下每次观察到的现象与结果，然后进行整理分析，写出实验报告。
5. 使用贵重精密仪器时要特别小心，注意保护，用毕要复原，并进行登记。
实验使用的一切物品实验完毕均放回原处。
损坏仪器照价赔偿。
6. 实验室要保持整洁、干净，不准大声喧哗，勿随意走动，严禁吸烟，不许吃东西，不准随便乱丢废物。
7. 实验过程中，一些易燃品如乙醇、丙酮等切勿接近火焰。
如遇火险，要先切断火源，再用沙土或湿布灭火，必要时应使用灭火器。
8. 使用过的废液及琼脂培养基不得直接倒入水池内，应先进行灭菌处理，然后再将废液倒入下水道，将琼脂培养基埋掉。
9. 离开实验室前要将桌面擦净，清扫卫生，检查电源、火源、自来水、门窗是否关闭，以确保安全。
实验一、絮凝菌分离、筛选准备实验（器皿的包装、无菌水、培养基的制备与灭菌）一、器皿的包装（一）实验目的学会微生物技术实验中所用器皿的包装方法及意义。
（二）包装方法1.培养皿的包装用牛皮纸或旧报纸进行包装。
包好后灭菌备用。
2. 吸管的包装在已干燥的吸管的平头端距0.5cm处，塞长约1.5cm的棉花，松紧要合适。
过松，棉花易脱出；过紧，吹吸费力，甚至吹吸不动。
棉花的作用是防止吸管中的细菌吸入口中，同时又防止口中的细菌吹入管中。
将塞好棉花的吸管的尖端，放在裁成4cm ~ 5cm宽的长报纸条的一端，吸管与纸条约成45º角。
折叠纸角，包住吸管尖端，然后以螺旋式在桌面上用力向前搓转，纸条将吸管包紧，余下的纸尾打成结。
将这样包好的几根或几十根吸管放一起，再用一张牛皮纸或两张报纸包装，然后干热灭菌。
3.三角瓶的包装在三角瓶的瓶口上塞上合适大小的瓶塞（棉塞或泡膜塑料塞），在瓶口外面包上2层至 3层报纸，扎好灭菌。
若进行湿热灭菌，最好再包一层牛皮纸或铝铂，以免打湿棉塞。
二、培养基的制备与灭菌（一）实验目的1．掌握培养基和无菌水的制备方法。
2．掌握高压蒸汽灭菌技术。
3．了解灭菌前的准备工作。
（二）材料1．培养皿（直径9cm）4套、移液管（10毫升、1毫升）、三角瓶（250毫升、150毫升、50毫升）、烧杯、量筒（100毫升）、漏斗、漏斗架；2．牛皮纸（或报纸）、纱布、棉花；3.玻璃珠、蒸馏水(配培养基用)；4.分离培养基：营养琼脂培养基；5.筛选培养基{发酵培养基（g/L）}：葡萄糖20 g , KH2PO42g , K2HPO45g , (NH4)2SO40.2g ,NaCl 0.1g ,尿素0.5g ,酵母膏0.5g）。
5.高压蒸汽灭菌锅、摇床、烘箱、电炉、冰箱等。
（三）操作步骤1．无菌水的制备在150mL三角瓶中加90mL蒸馏水，放20粒 ~ 40粒玻璃珠（用以打碎污泥颗粒，使其中的微生物游离出来），塞上硅胶塞，包扎好，灭菌备用。
2.培养基的制备（1）制备培养基的过程及要求①配制取一合适的干净烧杯，先加入一定量的蒸馏水，按培养基的配方依次称取各种成分，并依次加入蒸馏水中。
在有石棉网的电炉上加热，用玻璃棒不断地搅动，待药品全部溶解后，补加蒸馏水至所配体积。
若配制固体培养基，将琼脂加入继续搅拌，以防糊底。
②分装将配好的培养基分装于三角烧瓶中。
分装时培养基不能滴到瓶口上，以防瓶塞被污染。
分装量视需要及容器大小而定。
液体培养基的高度为容器高度的1/4～1/3。
（2）肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备按说明称取一定量的营养琼脂培养基于250毫升三角瓶中，根据（1）进行配制，趁热分装，塞好棉塞，包上牛皮纸，扎好，灭菌。
3.高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌法是利用高压蒸气锅进行灭菌的方法。
高压蒸气灭菌锅有自控式和非自控式两类。
实验室通常采用的是非自控式高压蒸气灭菌锅。
非自控式高压蒸气灭菌锅又分为手提式和卧式两种，其结构和基本原理相同。
压力锅上主要有压力表、加水口、排水口、安全阀、放气阀等；热源有电炉、煤气或蒸气。
高压蒸气灭菌锅的操作步骤及注意事项：（1）加水热源为蒸气的不需加水。
若为煤气灯或电炉的则应先加水（由加水口加水至水线）。
（2）将待灭菌的物品装进灭菌锅内（注意：物品不能放得太紧，否则，达不到灭菌效果），关严锅盖，同时拧紧对角线的一对螺旋，勿漏气。
（3）点火若为电源要插好插头，或打开开关；若为蒸气要缓慢地打开蒸气进口，蒸气不可过猛冲入锅内。
（4）锅内水沸腾后或压力为0.35kg/cm2时，开启放气阀，利用蒸气驱走锅内空气。
过几分钟，待达到100ºC或放出白色蒸气时，表明空气确已除尽，关闭放气阀（请注意：空气一定要排尽，否则，达不到一定压力时的相应温度，影响灭菌效果）。
（5）关闭放气阀后，随着蒸气的增多，锅内温度和压力随之升高，当达到所需压力时，即灭菌开始，此时要控制热源，以维持所需要的压力。
不同的物品，所需压力及灭菌时间长短不同。
牛肉膏蛋白胨培养基用1.05kg/cm2，灭菌20min；玻璃器皿和无菌水用1.05kg/cm2，灭菌30min。
（6）到预定灭菌时间后，切断热源，自然降压，指针回“0”时，打开排气阀（应注意：排气阀不能早早打开，以防因压力突然下降，培养基冲出，造成损失且弄湿棉塞）。
（7）揭开锅盖，取出物品，将剩余的水放掉。
（8）待已灭菌的物品（装有牛肉膏琼脂的试管除外）冷却后置于37ºC恒温箱内培养24h，若无细菌生长，贮于冰箱或阴凉处备用。
4.筛选模型的建立样品采集→稀释→富集培养→平板划线→挑菌落→纯化培养→初筛→富集培养→复筛→高效絮凝剂产生菌。
5.记录结果（1）你所做的培养基有无异常现象出现？请分析原因。
（2）培养不同种类的微生物能否用同一种培养基？请说明理由。
思考题1.请回答高压蒸气灭菌的操作及注意事项。
2.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中各成分的作用是什么？该培养基适于培养哪类微生物？3.配培养基时能否用自来水代替蒸馏水？为什么？实验2 絮凝菌的分离一、实验目的1．熟练掌握接种方法；2. 掌握纯种分离技术。
二、实验原理在土壤、活性污泥及生物膜等构筑物中，微生物都是以群体形式混杂在一起的，要了解其微生物间的相互关系、降解机理及优势类群，需要进行纯种分离。
纯种分离工作对污染控制也具有特别重要的意义。
将从自然环境中分离到的有着特殊降解能力的高效菌种，投放到处理系统中，可强化系统的处理能力，提高其处理效果。
要想得到某微生物的纯种，通常是根据其对营养、温度、pH值、溶解氧等条件的要求，选择不同的培养基，在一定的条件下进行培养，再用经过分离、纯化，直至得到纯菌体。
微生物絮凝剂是一类由微生物或其分泌物产生的高效、无毒、能生物降解的水处理剂,它克服了常规的无机絮凝剂和有机絮凝剂对人体有害和产生二次污染的缺点。
能产生絮凝性的微生物种类多,且具有广谱絮凝活性,因而具有广阔的应用前景。
目前,生物絮凝剂研制的关键问题是成本过高,因此,筛选高效絮凝剂产生菌,提高絮凝活性,降低成本成为生物絮凝剂研究工作者的首要任务。
三、仪器、材料1．显微镜、恒温培养箱、酒精灯、接种环、载玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯。
2 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、斜面培养基、无菌水、灭菌移液管、灭菌三角瓶、灭菌培养皿等。
以上材料均由实验1备妥。
四、操作步骤1．取样用无菌三角瓶取一定量的有代表性的活性污泥或生物膜样品，立即送实验室检测。
若不能马上处理，必须存入冰箱，但不得超过12h。
2．样品处理取20g （或适量）样品放入内有玻璃珠的无菌水中，振荡20min，将团粒打碎。
3．制平板将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基融化，然后冷却至45ºC左右，以无菌操作，倾注于无菌培养皿内，其厚度约为0.3㎝。
根据经验，直径为9㎝的培养皿一般倾注15mL～20mL培养基为宜。
倾注前，应先将盛有培养基的容器瓶口或管口于火焰上转烧一圈。
培养基注入后，立即盖好皿盖，平放于桌面上，轻轻转动，待凝固后，即成平板。
4.稀释分离（1）样品稀释称取10g样品，以无菌操作加到90mL 无菌水（内有玻璃珠）中，振荡，摇匀，浓度即为10-1的菌液。
（2）样品处理将稀释好的样品放于水浴锅（80度）处理25分钟。
（3）倒平板将培养皿编号。
在无菌条件下，先用1支1mL 移液管吸1mL菌液注入已编号的培养皿中。
每个培养皿中加入已融化且冷却至45ºC左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（注意：温度过高易将细菌烫死；过低易凝固），迅速轻轻地在平面上转动，使培养基与稀释液混匀（注意：不能沾到培养皿内壁上或溢出皿外）。
冷却后，30ºC恒温倒置培养48h，取出，放于冰箱停止培养，为实验3备用。
思考题1.絮凝菌的筛选为何先进行分离？2.怎样才能达到最好的分离效果？实验3 絮凝菌的筛选及絮凝性能的研究一、实验目的1.理解微生物的筛选概念2.掌握微生物筛选方法二、材料发酵培养基（由实验1准备）；4g/L高岭土悬浊液；5mL1%(wt %)CaCl2三、操作步骤1.3 筛选方法用接种环将实验三分离到的菌种接种到装有40ml发酵培养液的200ml三角瓶中进行预发酵培养,温度设定为30℃,摇床转速为160r/min ,18～24h后,按2.5 %的接种量将预发酵培养液接种到发酵培养基中进行发酵培养72 h (温度和摇床转速与预发酵同)。
通过测定各培养液的絮凝率进行初筛,对初筛获得的菌进行平行发酵培养,将絮凝率较高且稳定性较好的菌株作为复筛菌种。
1.4 絮凝剂样品的制备将发酵液于12000r/min 离心10min ,取上清液作为絮凝剂样品.1.5初筛，2mL培在100mL量筒中加入93mL 4g/L高岭土悬浊液，5mL1%(wt %)CaCl2养液，将量筒颠倒3～5次,目测,使高岭土悬浊液絮凝成较大絮状体的为有絮凝活性的菌株。
1.6 复筛在100mL量筒中加入80mL蒸馏水,0.4g高岭土,5mL1%的CaCl溶液,2mL絮凝剂2样品,然后加蒸馏水至100mL,调节pH 至7.0,溶液倒入150mL 烧杯中,放在磁力搅拌器上快速搅拌1min,慢速搅拌3min,静置3min,用吸管吸取一定深度的液层于722型分光光度计550nm处测定吸光度,以不加发酵液的吸光度为对照来确定菌发酵液的絮凝程度。
