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HPLC使用常见问题

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HPLC常见问题原因及解决方案

HPLC常见问题原因及解决方案

HPLC常见问题原因及解决方案一）压力异常操作压力的变化往往是故障的征兆。

A、没有压力显示，没有流动相流动：原因解决方法1、电源问题接通电源，开机2、保险丝被烧坏更换保险丝3、控制器设定不正确或设定失败采取恰当的设定、、修理或更换控制器4、柱塞杆折断更换柱塞杆5、泵头内有空气溶剂脱气、启动泵抽出空气6、流动相不足补充流动相、更换入口滤头7、单向阀损坏更换单向阀8、漏液拧紧或更换手紧接头B、流动相流动正常，但没有压力显示：原因解决方法1、仪表损坏更换仪表2、压力传感器损坏更换压力传感器C、压力持续偏高原因解决方法1、流速设定过高调整流速设定2、柱前筛板堵塞反冲色谱柱、更换筛板、更换色谱柱3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀使用恰当的流动相、冲洗柱塞杆。

4、色谱柱选择不当选择恰当的色谱柱5、进样阀损坏清洗或更换进样阀6、柱温过低提高温度7、控制器失常修理或更换控制器8、保护柱阻塞清洗或更换保护柱9、在线过滤器阻塞清洗或更换在线过滤器D、压力持续偏低：原因解决方法1、流速设定过低调整流速2、系统漏液确定漏液位置并维修3、色谱柱选择不当选择恰当的色谱柱4、柱温过高降低温度5、控制器失常维修或更换控制器E、压力波动：原因解决方法1、泵中有气体溶剂脱气、从泵中除去气体2、单向阀损坏更换单向阀3、泵密封损坏更换泵密封4、脱气不充分重新过滤一遍、溶剂脱气5、系统漏液确定漏液位置并维修6、使用梯度洗脱由于流动相粘度的变化引起的压力波动二）漏液通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。

但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。

如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。

A）接头处漏液原因解决方法1、接头松动拧紧2、接头磨损更换3、接头过紧拧松，再重新拧紧、更换4、接头被污染拆下清洗、更换5、部件不匹配使用同一品牌的配件B）泵漏液原因解决方法1、单向阀松动拧紧单向阀（不必拧的过紧）、更换单向阀。

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法[重点]

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法[重点]

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法诊状(一)保留时间变化可能的原因: 解决方法1.柱温变化:柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够:用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染:每天冲洗柱5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命:采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因: 解决方法1.流速增加:检查泵,重新设定流速2.样品超载:降低样品量3.键合相流失:流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加:柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失:同前(二)34.流动相组成变化:同前(二)45.温度降低:同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏:更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物:处理样品3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声:更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰:清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大:连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大:同(四)12.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载:进小浓度小体积样品液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

HPLC常见故障排除小贴士

HPLC常见故障排除小贴士

HPLC常见故障排除小贴士！高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。

鉴于HPLC在全行业运用越来越广泛，因此每一个实验室分析人员都应该熟练掌握并应用HPLC，对于一些常见的故障分析应该做到游刃有余，才能在运行故障的时候即使解决问题，提高工作效率。

以下是几个常见HPLC故障及对策分析方案。

保留时间发生漂移或快速变化原因？关于漂移问题：①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定；②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等；③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。

关于快速变化问题：①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定；②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出；③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合。

出现拖尾或双峰的原因？①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子；②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子；改换流动相或更换选择性好的柱子；③可能柱超载，减少进样量。

HPLC灵敏度不够的原因及解决办法①样品量不足，解决办法为增加样品量；②样品未从柱子中流出。

可根据样品的化学性质改变流动相或柱子；③样品与检测器不匹配。

根据样品化学性质调整波长或改换检测器；④检测器衰减太多。

调整衰减即可；⑤检测器时间常数太大。

解决办法为降低时间参数；⑥检测器池窗污染。

解决办法为清洗池窗；⑦检测池中有气泡。

解决办法为排气；⑧记录仪测压范围不当。

调整电压范围即可；⑨流动相流量不合适。

调整流速即可；⑩检测器与记录仪超出校正曲线。

解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

HPLC分析柱压不稳定的原因及对策①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；②比例阀失效，更换比例阀即可；③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

高效液相色谱仪常见故障及解决方法

高效液相色谱仪常见故障及解决方法

高效液相色谱仪常见故障及解决方法一、泵故障1. 故障现象：泵无法正常启动或启动后无法正常停止。

解决方法：检查泵头是否有污物堵塞，清除污物；检查泵头与控制器之间的连接线是否接触良好，如有松动，重新插紧。

2. 故障现象：泵的流量不稳定或无法调节。

解决方法：检查泵头是否有污物堵塞，清除污物；检查泵头与控制器之间的连接线是否接触良好，如有松动，重新插紧；检查泵头与柱塞之间的密封圈是否损坏，如损坏，更换密封圈。

二、流动相跑空1. 故障现象：流动相液位下降至最低液位以下，导致无法正常进样。

解决方法：检查流动相的储液瓶是否已空，如已空，重新更换储液瓶；检查流动相的流速设置是否正确，如不正确，重新设置流速；检查管路是否有泄漏点，如存在泄漏点，修复泄漏点。

2. 故障现象：流动相液位迅速下降，导致无法正常进样。

解决方法：检查废液瓶是否已满，如已满，倾倒废液；检查管路是否有堵塞或弯折，如有，更换管路或调整管路布局。

三、峰面积重复性差1. 故障现象：同一色谱条件下，每次运行同一色谱图时，峰面积重复性差。

解决方法：检查进样阀的切换次数是否过多，如过多，减少切换次数；检查进样针的清洗是否彻底，如不彻底，加强清洗；检查样品前处理的稳定性是否可靠，如不可靠，重新进行样品前处理。

2. 故障现象：不同色谱条件下，每次运行同一色谱图时，峰面积重复性差。

解决方法：检查流动相的组成是否恒定，如不恒定，重新配制流动相；检查色谱柱的稳定性是否可靠，如不可靠，更换色谱柱；检查检测器的波长是否准确，如不准确，重新调整波长。

四、峰丢失1. 故障现象：在色谱图中看不到预期的峰。

解决方法：检查进样针是否堵塞或断裂，如堵塞或断裂，更换进样针；检查进样阀的切换次数是否过多，如过多，减少切换次数；检查样品前处理是否可靠，如不可靠，重新进行样品前处理。

2. 故障现象：在流动相中添加了某种物质后，出现了预期之外的峰。

解决方法：检查流动相中添加的物质是否稳定，如不稳定，重新配制流动相；检查检测器的灵敏度是否足够高，如不够高，调整灵敏度；检查色谱柱的类型是否正确，如不正确，更换色谱柱。

高效液相色谱常见故障及解决方案

高效液相色谱常见故障及解决方案

高效液相色谱常见故障及解决方案1.压力过高或过低-压力过高可能是由于柱堵塞或流动阻力增加所致。

解决方案包括更换柱、清洗柱或检查管路是否存在问题。

-压力过低可能是由于泵的磁力搅拌器不工作或进样器封堵所致。

解决方案包括检查泵的磁力搅拌器是否工作正常，清洗进样器。

2.峰形不对称-峰形不对称可能是由于进样量不均匀或柱温度过高所致。

解决方案包括确保进样量均匀和降低柱温度。

3.峰尾或前肩-峰尾可能是由于柱温度过高、流速过快或流动相pH值不合适所致。

解决方案包括降低柱温度、减慢流速或调整pH值。

-前肩可能是由于流动相中存在杂质或柱堵塞所致。

解决方案包括更换流动相或清洗柱。

4.杂峰或基线噪声-杂峰可能是由于样品纯度不高、固定相老化或试剂污染所致。

解决方案包括提高样品纯度、更换固定相或检查试剂是否污染。

-基线噪声可能是由于进样器密封不良、流动相气泡或电噪声所致。

解决方案包括检查进样器密封情况、减少流动相中的气泡或检查电子设备是否存在干扰。

5.柱寿命短-柱寿命短可能是由于样品预处理不彻底、柱收尾不当或流动相pH值不合适所致。

解决方案包括增加样品预处理步骤、正确收尾柱或选择合适的流动相pH值。

6.流量不稳定-流量不稳定可能是由于柱堵塞、进样器密封不良或流动相流速波动所致。

解决方案包括清洗柱、检查进样器密封情况或调整流动相流速稳定性。

7.进样量偏差-进样量偏差可能是由于进样器封堵、进样器针头磨损或进样器流速不稳定所致。

解决方案包括清洗进样器、更换进样器针头或调整进样器流速稳定性。

8.柱温度不稳定-柱温度不稳定可能是由于温控系统故障或环境温度变化所致。

解决方案包括检查温控系统是否工作正常或采取措施保持恒定环境温度。

这些是HPLC常见故障及其解决方案的例子。

在实际操作中，操作人员应该根据具体情况诊断和解决故障，并遵循相关的操作规程和安全操作指南。

HPLC 常见故障分析及排除方法

HPLC 常见故障分析及排除方法
Accum. Head
Primary X-ducer
Primar y Head
Prime/Vent Valve In-Line Filter
GPV
From Degasser
To Sample Management System
©2010 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 13
©2010 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 26
HPLC常见故障因素 2487/2489
错误信息
Lamp lighting failure 氘灯启动失败 解决： 检查电源 检查氘灯使用时间
Peak not found: 656 nm Deuterium Peak not found: Erbium n nm
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
0
5
10
15
分
2 星期
1 星期
1天
1 小时 新鲜配制
20
25
©2010 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 10
例如，根据不同的应用使用 80% 水:20% 甲醇的溶液或 80% 水:20% 乙腈的溶液
©2010 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 16
2695 故障 2690初始化错误： Plunger homing over pressure

液相常见问题

HPLC常见问题及解决办法1.保留时间的变化（对于反相液相色谱，正相相反）1.1怎么样缩短保留时间（1）加大流速（2）加大有机相（A相）比例，极性缩小，其基本原理可以用相似相容原理解释，以此也可以用来解释薄层色谱中极性过大，点会出现在溶剂前沿。

（3）梯度洗脱，N分钟后（前面峰出来之后），加大A相比例。

与（2）相比更适用，如果直接加大有机相比例，可能导致前面的峰分不开。

（4）改变有机相，换成洗脱能力更强的，如甲醇换成乙腈。

（5）适当调高柱温。

（6）柱子缩短，减小柱子的内径，1.2 如何延长保留时间（1）换新柱子，新柱子一般较旧柱子保留时间长，当然指的是同等规格的柱子。

(2)色谱柱填料粒径减小，延长保留时间，分离效果和柱效变高。

但是粒径和孔径的变小，会使柱压升高，，因而会用比较小的流速，从而造成分离时间的延长和一定程度的峰展宽。

（3）其他的方法与缩短保留时间的方法相反。

2.怎么样提高分离度（1）一般提高液相的分离，主要就是从增加色谱柱的理论塔板数，从而提高柱效，使分离效果更好。

减小色谱柱填料的粒径。

使用粗长的色谱柱。

（2）提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高。

（3）延长保留时间。

3.谱峰拖尾影响因素（1）在缓冲不好或离子强度过低的分离中，也会出现保留值重现性差和峰拖尾。

增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能大大改善此情况。

（2）干扰峰的影响，通过使用更长的色谱柱或改变流动相的比例，可以减小干扰峰的影响。

（3）筛板阻塞，解决方法有a反冲色谱柱b更换进口筛板、c更换色谱柱（4）色谱柱塌陷，可以通过填充色谱柱来解决。

（5）流动相PH选择错误，调整PH，对于碱性化合物，低PH更易于得到对称峰。

hplc 常见故障分析及排除方法

System X-ducer Primary X-ducer
Accum. Head
Primary Head
GPV
Prime/Vent Valve To Sample Management System
From Degasser
In-Line Filter
•注意流动相组分的互溶性！ •使用正确的 Seal Wash 溶剂！
996 二极管阵列检测器 PM Kit
请使用Waters正品部件
Waters Quality Parts
Waters
非Waters 密封圈 正品密封圈
请使用Waters正品部件
P rr o p e l y ce he ad m f r s a m p l e p o r t
I rr m p o p e m a g c h i n i n opt fm s p a o l r e
• 清洗柱塞杆密封（Seal Wash）
HPLC 常见故障因素（717/2690进样器）
其它注意事项：
• 打开样品仓盖后，等待样品盘停止转动后再取出 • 关机前取出所有样品瓶，或将样品盘全部取出
• 注意保持样品仓内和样品盘清洁
• 请使用 Waters 公司认可的样品瓶 • 使用微量进样瓶请设定正确的针尖高度值（Depth of Needle〕
化学品的影响
• 已损坏的保护柱、色谱柱 • 所用溶剂、试剂的品质 • 化学品使用不当带来的影响 • 样品前处理方法不当带来的影响 • 实验前的准备和实验结束后的收尾工作
HPLC 常见故障因素（泵）
515 510
1515/1525 600
2690/2695
HPLC 常见故障因素（泵）
正确使用您的色谱泵：

高效液相色谱使用中常见问题及对策

高效液相色谱使用中常见问题及对策
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分
析技术。

在使用HPLC的过程中，可能会遇到一些常见问题，以下是一些可能的问题及对策：
1. 峰形不对称或分离不良：可能是由于柱问题引起的。

可以尝试更换柱，确保柱的性能良好，
并尽量避免超出柱的最大推荐压力。

2. 峰形峭度低：这可能意味着分离不充分。

可以尝试调整流动相的组成、pH值或流速来改善
分离。

3. 噪音较大：可能是由于进样器或检测器的问题引起的。

可以检查进样器和检测器的状态，并
确保它们正常运行。

4. 色谱柱寿命较短：这可能是由于样品中的杂质或试剂导致的。

可以尝试优化样品的准备方法，如前处理或过滤样品，以减少对柱的损害。

5. 流动相配制错误：这可能导致峰错位或分离不良。

可以仔细检查流动相的配制方法和溶剂的
纯度，确保配制正确。

6. 峰定量不准确：可能是由于进样量不准确或方法参数设置不合适引起的。

可以检查进样量的
准确性，并根据实际情况调整仪器参数。

7. 泵压过高：可能是由于管路堵塞或柱封堵引起的。

可以检查管路是否通畅，并根据需要更换
柱或清洗柱。

8. 柱渗漏：可能是由于柱端部密封不良或柱老化引起的。

可以检查柱端部的密封情况，并确保
柱处于良好状态。

针对以上问题，及时检查、调整和维护HPLC设备，并根据具体情况进行修复或更换，可以提
高HPLC分析的效果和结果的准确性。

GC,HPLC,GCMSD使用过程中常见问题解答

- 检查检测器的氘灯是否已经到了使用寿命，是否更换过新的氘灯。DAD 光强 测试可见光不通过，也可能是氘灯问题，因为氘灯用久了外部发黑挡住了可 见光的通过。
- 用异丙醇清洗整个系统，更换过滤芯，排除污染源。
- 清洗流动池和有关的透镜（需要工程师去现场服务）
7. HPLC 出“鬼峰”，如何排除？
HPLC 出“鬼峰” 大部分发生在反相体系（甲醇， 乙腈， 水），是溶剂被污染 造成的。还有一种原因是进样系统有残留。
6. NPD 灵敏度低的原因和处理方法。
- NPD 灵敏度低，铷珠电压高或者难激发，首先检查衬管，确认衬管干净。很 多情况并不是铷珠问题，而是 NPD 本身污染，建议清洗。此外，建议用户使 用钢瓶气，发生器的质量很难保证。
7. GC 出“鬼峰”，如何排除？
GC 出“鬼峰”的原因很多，需要一步一步排除。
- 清洗分流出口（需要工程师提供现场服务）
2. 保留时间不重现
- 检查分析方法的设定，如果用程序升温的方法，确认要有足够的平衡时间（5 分钟以上）
- 如果使用 FID 或 NPD，请指导操作人员清洗一下喷嘴。喷嘴的轻微堵塞也会 影响保留时间。
3. FID 点火困难
FID 点火故障是比较常见的。请检查以下几个方面： - 确认气体的种类，连接是正确的，特别是如果用户换过气体钢瓶，发生器或
5. 调谐评价显示真空很好，18 和 28 都很低，但是 502 丰度小于 3%。
先检查离子源温度，如果离子源温度高于 230 度，要先把它降到 230 度。因为离 子源温度越高，502 的丰度就越低。然后检查 Repeller 电压，你可以适当提高 Repeller 电压的最高限制，比如说 35 伏。较高的电压可以得到较高的 502 相对 丰度。如果这些措施都无效，可能需要清洗离子源。
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柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
平衡时间：大于30min，且基线平稳。
8
常用的脱气方法
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连 续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发 污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振 荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗 透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本 低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元 溶剂体系。
17
9）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全 装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量 最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最 多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准 确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最 少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最 少进样 60 至 100 μl的样品，这样才能完全置换 样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密 度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合 20ul满环进样。
6
流动相的配制
按色谱条件，以一定比例混合流动相 后，抽滤（ 0.45µm滤膜），超声脱气。
7
滤膜类型 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸 和盐。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特 别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂 和水溶液，可以用于强酸，不适用于二 甲基甲酰胺。
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色谱柱的故障
滤片或填料堵塞 样品或流动相中杂质吸附 机械振动产生空隙 填料变性
39
滤片或填料堵塞
使用预柱 缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤 样品溶液使用0.45um滤膜过滤
36


柱子的保养
1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动 2)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲 时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱 效。 3)选择使用适宜的流动相(尤其是pH2-8)，避免使用高粘度 的溶剂作为流动相；有时可以在进样器前连接一预柱，分析柱 是键合硅胶时，预柱为硅胶，流动相在进入分析柱之前被硅胶 “饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 4)要注意流动相的脱气； 5)进样样品要提纯；避免将基质复杂的样品尤其是生物样品 直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱 之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，保 护柱可以而且应该经常更换; 严格控制进样量；
4
溶剂的要求
流动相所用溶剂必须为色谱级 水为重蒸水或超纯水 缓冲液的PH值范围一般为2-8（取决于所
用柱子的性能）
5
HPLC用水可以通过以下几个方面来得到
专门的纯水机或超纯水机； 去离子水重蒸；采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质 越高放置时间越短。 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲 液 建议不超过两天。
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基线噪声
可能的原因 1.气泡(尖锐峰) 2.污染(随机噪声) 解决方法 流动相脱气； 清洗柱,净化样品,用HPLC级试 剂； 3.检测器灯连续噪声 更换氘灯； 4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源 检查干扰的来源 5.检测器中有气泡 流动相脱气
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峰拖尾
可能的原因 1.柱超载 2.峰干扰 3.硅羟基作用 解决方法 降低样品量,增加柱直径采用较高容量 的固定相； 清洁样品,调整流动相； 加三乙胺,用碱致钝化柱，增加缓冲 液或盐的浓度，降低流动相PH值,钝 化样品
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紫外灯的保养
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器； 在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养
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二、常见问题分析
色谱图常见问题
保留时间变化

保留时间缩短 可能的原因 1.流速增加 2.样品超载 3.流动相组成变化 4.温度增加
解决方法 检查泵,重新设定流速 降低样品量 防止流动相蒸发或沉淀 柱恒温
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5. 柱塌陷或形成短路通道 6. 死体积或柱外体积过大
7. 柱效下降 8. 采用流动相溶解样品
更换色谱柱 连接点降至最低,对所有连 接点作合适调整,尽可能采 用细内径的连接管 更换柱,采用保护柱 避免溶剂效应
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样品溶剂效应
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峰展宽
可能的原因 : 解 决 方 法 1. 进样体积过大； 2. 在进样阀中造成峰扩展，进样前后排出气泡，以降低扩 散； 3. 数据系统采样速率太慢，设定速率应是每峰大于10点； 4. 检测器时间常数过大，设定时间常数为感兴趣第一峰半 宽的10%； 5. 流动相粘度过高，采用低粘度流动相； 6. 保留时间过长，等度洗脱时增加溶剂含量，也可用梯度 洗脱； 7. 样品过载 进小浓度小体积样品 ；
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10）进完样后一定要及时冲洗进样器，特别是用盐或缓冲液作 流动相，由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈。 冲洗方法： A. 将进样器转至Inject位置，利用液相泵输送高纯水 冲洗(这时是冲洗样品环及沟槽）. B.用阀清洗接头和注射器冲洗。
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实验结束后
对于反相柱，如果流动相含缓冲液，请按如下程序冲 洗色谱柱：10％甲醇水冲≥ 60分钟 ，再换100％甲 醇冲≥40分钟；如果流动相不含缓冲液，则用纯甲醇 冲≥ 60分钟。 自动液相色谱仪，缓冲盐通路上的泵要换上水并清洗 通路。 手动进样阀清洗：冲洗色谱柱时，在‘Load’状态， 使用注射器用溶解样品的溶剂冲洗两到三遍，然后到 ‘Inject’状态，让定量环随柱一起冲洗，冲完柱后， 插入堵头，防止灰尘进入定量环。手动进样针必须用 溶解样品的溶剂冲洗干净，最后用甲醇冲洗两到三遍。
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进样
Agilent 1100 手动进样器（G1328A,G1328B)
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Agilent 1100 手动进样器工作原理
六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进 样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组 成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用， 各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
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柱性能评价 柱性能指标包括在一定实验条件(试验样品、 流动相、流速、温度)下的：
柱压 理论塔板高度和理论塔板数 对称因子、容量因子 分离度等
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色谱柱的使用及操作
流动相的转换 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
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鬼峰
1. 进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和 样品的清洗 2. 样品中未知物 : 处理样品 3. 柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其 是离子对色谱) 4. 水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用
HPLC级的水
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色谱柱

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构造
色谱柱是色谱仪的最重要部件，它由柱管和固定相组 成。柱管多用不锈钢制成，压力不高时，也可采用厚 壁玻璃和石英管，管内壁要求有很高的光洁度。 高效液相色谱柱几乎都是直形，按主要用途分为分析 型和制备型，它们的尺寸规格也不同。 色谱柱两端的柱接头内装有烧结不锈钢滤片，其孔隙 小于填料粒度，以防止填料漏出。
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脱气 除去流动相中溶解或因混合而产生的 气泡
气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间 和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
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为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起 到 保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。


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7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 用适 当的溶剂来清洗柱； 8)保存色谱柱时应将柱内充满乙睛或甲醇，柱接头要拧紧， 防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或 更长时间。 9)色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片 被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是 大分子进入柱内，使柱头被污染；如果校效降低或色谱峰变形， 则可能柱头出现窝陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小 心拧开柱接头，用洁净小钢铲将柱头填料取出1-2mm高度 (注意把被污染填料取净)，再把柱内填料整平。然后用适当溶 剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，并拧紧柱接 头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂 和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞 和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞 的磨损。
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色谱柱平衡
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
7）手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上 引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。 8）在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平 头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧， 密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止 了针头刺坏密封组件及定子。手动进样时应注意，针中 不能有气泡，在Load状态进样时推针要慢，由Load切换 到inject时动作要迅速，停留半分钟后取针，进样后应 洗针。