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罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性王蓓;李桂欢;王培;汤菊芬;鲁义善;吴灶和;简纪常【期刊名称】《渔业科学进展》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】Streptococcus is a genus of spherical gram-positive bacteria that can infect a wide range of hosts. Streptococcal diseases of cultured fish caused by Streptococcus agalactiae have been frequently reported in South China, which incurred catastrophic economic losses. Vaccine is one of effective ways to control and eradicate infectious diseases, and so far no effective subunit vaccine for S. agalactiae diseases has been developed. To test whether Hemolysin (Hly) is a potential candidate for vaccine development of Oreochromis niloticus, we cloned hly gene based on bioinformatics analysis and constructed and expressed it. The open reading frame of hly gene contains 1335 bp that encodes 444 amino acid residues. Alignment analysis indicated that the Hly protein was highly homologous to Hly proteins from other Streptococcus(99%). SDS-PAGE confirmed the expression of Hly (51.7 kD) in Escherichia coli BL21(DE3). Then, the recombinant Hly protein was purified by affinity chromatography, which was used for vaccination in Tilapia, O. niloticus. Immunogenicity was confirmed by subsequent western blotting. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis demonstrated that Hly produced an observable antibody response in all vaccinated fish, and the maximum antibody titersin the sera reached 1:4096. The RPS value for the Sip vaccine was 70. Tilapia vaccinated with Hly was highly resistant to the infection of the contaminant S. agalactiae. These results indicate that Hly is an effective vaccine candidate against S. agalactiae for tilapia, O. niloticus.%为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin, Hly)对鱼体的免疫保护作用，根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因，定向克隆于原核表达载体pET-28a中，构建原核重组质粒pET-28a-hly，经IPTG诱导表达后，制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼，并分析疫苗的免疫保护力。
吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【摘要】利用重叠延伸（SOEing）PCR技术，将吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae） ZQ0910株表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因通过Linker序列融合，构建成为Sip-GAPDH融合基因。
将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。
结果表明，重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21（DE3）中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD，表达最佳条件为37℃，IPTG浓度0.1 mmol/L，诱导5 h。
Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。
%The DNA fragment encoding the Sip and GAPDH gene of Streptococcus agalactiae strain ZQ0910 isolated from GIFT Strain of Nile Tilapia(Oreochromis niloticus)were obtained by PCR. The Sip-GAPDH gene was constructed in a Sip-linker-GAPDH format with the standard 15-amino acid linker(Gly4Ser)3 by SOEing PCR technique, and the final full length product was cloned into the pET-32a(+)vector for protein expression in Escherichia coli strain BL21(DE3). The result showed that the expression fusion protein Sip-GAPHD were about 102.01 kD and Western blotting analysis confirmed that the 102.01 kD protein was the fusion protein, because it was specifically recognized by mouse anti-His monoclonal antibody. Inducing the cells at 37℃in 0.1 mmol/L of IPTG for 5 hours wasthe optimal conditions for expression of the recombinant Sip-GAPDH fusion protein.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】6页(P137-142)【关键词】无乳链球菌;Sip-GAPDH融合基因;重叠延伸PCR技术;原核表达【作者】王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【作者单位】广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088; 仲恺农业工程学院，广州 510225;广东海洋大学水产学院，湛江524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088【正文语种】中文罗非鱼，又被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织推荐的21世纪最有发展前景的淡水养殖品种［1，2] 。
罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2018(000)006【摘要】本文利用终浓度为0.5％(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法.此检测方法的抗原最适包被浓度为1×107 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1:100(v/v),二抗最适工作浓度为1:2000(v/v),最低检测限为1×104 CFU/mL.利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80％,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应.【总页数】4页(P213-215,219)【作者】赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【作者单位】海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南大学【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立 [J], 吴金花;布日额;王金良;陈金龙;锡林高娃;孙立杰;王华;王学理;刘燕2.牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 [J], 布日额;任晓峰;吴金花;王学理;刘燕;锡林高娃;孙立杰;刘洋3.牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立[J], 郎景民;布日额;孙立杰;刘娣;吴金花;锡林高娃;刘燕;史芬芳4.罗非鱼源无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法 [J], 祝璟琳;李大宇;肖炜;邹芝英;杨弘5.以重组无乳链球菌GapC1-150作抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立[J], 刘硕;崔玉东;王欣;李皖豫;马骏;范钊伟;王然;段旭阳;周玉龙;朱战波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
罗非鱼无乳链球菌 EsxA 基因克隆与原核表达马艳平;梁志凌;马江耀;刘振兴;郝乐;柯浩【摘要】Ⅶ型分泌系统（T7SS）是近年来发现的分泌系统，分泌两种胞外蛋白，EsxA 基因编码的 ESAT6蛋白和 EsxB 基因编码的 CFP-10蛋白。
分泌蛋白具有良好的免疫原性，促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能，与致病性密切相关。
以罗非鱼源无乳链球菌为模板，克隆到294 bp 的 EsxA 基因，将目的序列克隆到 pMD18-T 载体，经测序，目的序列与无乳链球菌 EsxA 基因同源率在99％以上。
EsxA 基因克隆到 pET32a 载体中，重组载体在28℃、0．5 mmol／L IPTG 诱导条件下表达量最大，可溶性表达。
将纯化的ESAT6蛋白免疫 Balb／c 鼠，成功制备 ESAT6蛋白鼠多克隆抗体，经 Western blot，ESAT6蛋白具有良好的反应原性。
研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。
%New discovered type Ⅶ secretion system (T7SS)secrets two extracellular proteins including Es-xA coded ESAT6 and EsxB coded CFP-10,which is related to pathogenicity closely.ESAT6 and CFP-10 proteins have diverse functions such as promoting bacteria from phagosome of macrophage,impacting mac-rophage apoptosis and lysis.The two secreted proteins in T7SS of Streptococcus agalactiae form the ho-mologous dimmers,collectively known as ESAT6 protein,may be bacterial adhesion protein showing im-portant for host-cell attachment and invasion in S.agalactiae through bioinformatics analysis.But ESAT6 protein whether has the virulence and its pathogenesis is not clear,therefore it is necessary to study on it. We cloned 294 bp sequence from tilapia Streptococcus agalactiae .And the sequencewas cloned into pMD18-T vector,the homology is 99% with tilapia Streptococcus agalactiae EsxA gene.EsxA gene was cloned into pET32a vector.The best solouble expression was under 0.5 mmol/L IPTG,28℃.In addition, the purified protein was used to immunize Balb/c mice to prepare mouse anti-ESAT6 protein antibody.ES-AT6 protein had sastisfied reactogenicity through Western blot test.These results encouraged further re-search for the immunological function of S.agalactiae ESAT6 protein.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)004【总页数】5页(P35-39)【关键词】Ⅶ型分泌系统;无乳链球菌;EsxA 基因;克隆与表达【作者】马艳平;梁志凌;马江耀;刘振兴;郝乐;柯浩【作者单位】广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640【正文语种】中文【中图分类】S852.4;Q789Ⅶ型分泌系统(type Ⅶ secretion system, T7SS)由多种组分构成，分泌两种具有免疫原性的胞外蛋白，即EsxA基因编码的早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigen target 6，ESAT6)和EsxB基因编码的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10, CFP-10)。
罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55的研发关键词：罗非鱼；无乳链球菌；口服纳米疫苗；安全性；免疫保卫效果1. 探究背景罗非鱼（Oreochromis niloticus）是一种广泛分布于非洲及其周边地区的淡水鱼类，在我国南方也有一定的养殖量。
然而，罗非鱼的养殖过程中常会受到无乳链球菌（Streptococcus iniae）的侵略，造成罗非鱼免疫力下降，生长缓慢，死亡率高等问题，影响养殖产业的健康进步。
传统的防治方法主要接受化学药物，但存在着毒性大、残留问题、对环境造成污染等弊端。
因此，研发一种安全有效、环保的预防性疫苗，成为当下解决该问题的重要途径。
2. 探究内容本探究接受纳米技术制备了罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55，将其利用口服方式给罗非鱼接种，从而降低给药难度，提高了防治效果。
起首，通过搭建无乳链球菌的鼠亚急性毒性试验，评判了该疫苗的毒性，结果显示该疫苗具有较好的安全性。
同时，对该疫苗的免疫保卫效果进行了探究。
体外试验发现，该疫苗能够增进罗非鱼细胞的增殖，并提高它们对无乳链球菌的保卫能力；动物试验结果表明，该疫苗的接种能够显著降低罗非鱼患病率，提高罗非鱼的存活率。
3. 结论本探究成功制备了一种安全有效的罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55，该疫苗具有良好的免疫学安全性和免疫保卫效果，为罗非鱼养殖防病提供了新的、安全有效的防治手段。
同时，本探究对口服纳米疫苗的研制提出了新的思路和方法，具有一定的理论和实践意义。
关键词：罗非鱼；无乳链球菌；口服纳米疫苗；安全性；免疫保卫效果养殖产业是重要的经济支柱，但由于养殖环境狭窄、密度高等原因，导致养殖动物易发生疾病。
传统的防治方法主要接受化学药物，但由于毒性大、残留问题、对环境造成污染等问题，导致养殖业成为了环境和食品安全的重要隐患。
因此，研发一种安全有效、环保的预防性疫苗，成为解决该问题的重要途径。
罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌【摘要】LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一.为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因.分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48％.LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位.将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6h.SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在.经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL.鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28％,且免疫后4周的血清抗体滴度为1:800.该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2014(038)005【总页数】9页(P713-721)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;LrrG蛋白;原核表达;蛋白纯化;免疫原性【作者】陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380【正文语种】中文【中图分类】Q785;S941罗非鱼(Oreochromis spp.)具有食性杂、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，是世界范围主要养殖品种之一。
尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【期刊名称】《水产学杂志》【年(卷),期】2024(37)2【摘要】通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。
结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。
结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。
【总页数】9页(P46-54)【作者】张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【作者单位】东莞市动物疫病预防控制中心;佛山科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S965.125【相关文献】1.罗非鱼无乳链球菌巢式 PCR 检测方法的建立2.基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法的建立及应用3.罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR 检测方法建立4.罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。
2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌（Streptococcus iniae）和无乳链球菌（S.agalactiae）。
目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。
疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。
目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。
研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。
本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein,Sip）的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。
研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。
采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。
研究结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。
