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Western blot 之生理宝典样品的制备1. 收细胞1.1 从-20℃取出细胞裂解液和蛋白溶解酶抑制剂片剂，每2毫升细胞裂解液加四分之一片蛋白溶解酶抑制剂片剂,置于4℃冰上，此步骤需新鲜配制；1.2 取出灭菌EP管，做好标记，置于4℃冰上；1.3 取出六孔板（含有培养细胞），去培养基，每孔用10ml移液管加入4℃PBS 1ml，移去，每孔用移液枪加入60-100微升细胞裂解液（已加入蛋白溶解酶抑制剂）,吹打，用细胞刮将贴壁细胞刮下，吹打，用移液枪吸到已标记的EP管中，置于4℃冰上，注意细胞刮每次刮完一孔用纸巾擦净，再刮下一个，刮的时候要保证各个方向都刮到。
1.4 如需保存，将EP管置于-80℃。
2. 收组织2.1 向放有组织的EP管中加入细胞裂解液（含PMSF），每250mg组织加入1ml裂解液，不足100µl的，补至100µl。
2.2 将含有裂解液的组织用干净镊子或小剪刀剪碎，越碎越好。
（冰上操作）3. 提蛋白3.1 将含有裂解液的细胞液或组织悬浊液用超声仪裂解（4℃冰上操作），每支离心管超声10次，每次1s。
每管超声后，超声仪金属头部需用PBS或蒸馏水清洗（洗瓶清洗），再用滤纸吸干。
超声仪金属头部不可插入EP管过深，否则会有细胞液溅出。
3.2 充分裂解后，4℃、12000r离心10min，取上清，快速加入到已标记的EP管中。
4. 测蛋白浓度4.1细胞蛋白液细胞密集时，则从原液中抽出5µl，再加30µl PBS，稀释7倍；细胞稀疏时，则从原液中抽出7µl，再加28µl PBS，稀释5倍。
剩余母液放入4℃。
4.2 组织蛋白从原液中抽取2µl，再加38µl PBS，稀释20倍。
剩余母液放入4℃。
4.3 用倍倍稀释法，制作标准蛋白梯度，即0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025µg/µl标准蛋白4.4 在96孔板内加入BCA工作液，每孔100µl，再将各浓度标准蛋白和稀释样品点入含有BCA液体的孔内，每孔10µl（BCA工作液配制时需要多配，以防不够用）。
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg，减去气管，组织匀浆机研磨，100W超声3S，12000r/min离心37℃孵育30min，测OD562。
按所得结果定量到50微升计算上样量，将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管，加5微升上样缓冲液，-20℃冻存。
二、煮样95℃，煮10min,待温度降到室温关闭机器，煮后的组织离心7500r/min，1min备用三、安装玻璃板，倒入电泳缓冲液，拔梳子，用进样针吸取计算的上样量上样，装好正负极，倒满电泳液，设置80V，30min跑条带，结束后100V，60min，没跑到底酌情延长时间(30min)，准备转膜所需工具：1.剪好6片滤纸，转膜液湿润海绵及滤纸，赶气泡。
2.PVDF膜，准备甲醇激活膜2min，蒸馏水5min电泳时间到关闭电源，取出玻璃板，准备切胶，切好后，按形状切稍大一圈的PVDF膜，覆盖到切好的胶上，标记好上下。
安好夹子，放入电泳槽准备转膜，转膜需冰浴。
四、转膜结束后，将膜取下，TBST清洗3遍，每遍5min。
五、7%牛奶（1.75g，加TBST 25毫升）,封闭2小时，慢摇。
六、封一抗内参：β-actinα-SMA:1：10000配制波形蛋白：1：5000制备杂交袋，放入膜，滴入抗体，封口，4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min，结束后回收一抗，标记好第几次用，TBST清洗膜3遍，每遍10min。
八、封二抗：羊抗兔HRP(1：5000)稀释，配制10ml，慢摇1小时后回收二抗，标记好第几次。
TBST清洗膜3遍，每遍15min。
九、1：1配制发光液（避光保存），准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光，先曝背景再报条带，先自动后手动。
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
western blot
（以17KD的H3K9me2蛋白为例）
准备：
（1）电转液：称3.03 g Tris碱，14.5 g Glycine，加入200 ml甲醛，溶解后加双蒸水定容至1000 ml，4 o C保存。
（电转液最好现用现配，但是我咨询过的几个实验室同学，一般是重复使用3-4次的，当然电转液最好每周重新配，即使还没用到3-4次）.
（2）5×电泳缓冲液：称15.1g Tris碱，94 g Glycine，5.0 g SDS，定容至1000 ml，4o C保存。
使用时用双蒸水稀释成1×电泳缓冲液。
（3）封闭液：称1.5 g脱脂奶粉，加入30ml TBST充分溶解，现用现配。
（4）10×TBS 缓冲液：称24.2g Tris碱，80 g NaCl，加入800 ml双蒸水，整PH 到7.6，定容至1000 ml。
（5）1×TBS缓冲液：100ml 的10×TBS 缓冲液，加入0.5mlTween20,再加双蒸水定容至1000ml。
1.细胞总蛋白的提取：（提前开4℃离心机，水浴锅调到100℃，裂解液、PMSF和上样缓冲液取出放在冰盒里溶解）
取出细胞，弃去培养液，加3 ml 4℃预冷的PBS。
平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液，将把细胞消化下来，加入PBS重悬，将悬液移到1.5ML的进口EP管内。
加入含PMSF的裂解液（提前按100：1的裂解液：PMSF（100 mM）配好混匀于冰上备用，第一次做可按六孔板一孔加100ul,10cm的培养皿加400ul这个量试试，以后可视蛋白浓度来增减裂解液的量），摇匀置于冰上，超声15min后，取出于4℃下12000 rpm 15min,取上清液。
分装出20ul的蛋白用来测蛋白质浓度，余下的蛋白加入5×上样缓冲液（加入的蛋白与5×上样缓冲液的比例为：使最终5×上样缓冲液稀释为1×，例如蛋白360ul, 5×上样缓冲液90ul），100℃煮5-10min,待冷却，放到-80℃保存（可保存一个月）。
2.BCA法测蛋白浓度
先绘制标准曲线：各管按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7，蛋白标准溶液（μl）0 1 2 4 8 12 16 20 ，去离子水（μl）20 19 18 16 12 8 4 0 。
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；各管加入200 μl BCA工作液；各管充分混匀，37℃放置30 min，然后在562 nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为20 μl，加入BCA工作液200 μl，充分混匀，37℃放置30 min后，以标准曲线0号管做参比，在562 nm波长下比色，记录吸光值；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20 μl），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μl）。
（注意：不同的BCA试剂盒的方法有差异，要按试剂盒说明书来操作，以上方法是碧云天的BCA试剂盒）
3.配分离胶和浓缩胶（以碧云天的试剂盒为例）
17KD的蛋白选择12%或15%的分离胶都可以（胶要提前配，冬天温度低不易凝，可以在实验前一天晚上配好，放在4度室，夏天提前2小时左右配就可以了。
）配制12％分离胶，及5％积层胶使用的试剂购自碧云天，配制方法就参照碧云天的protocol（不同的配胶的试剂盒就按其配给的protocol配）
4电泳
加入1×电泳缓冲液灌满小槽，确保电泳全程电泳缓冲液能浸没矮玻璃板上缘，大槽需加至刻度线2位置（小槽内的电泳缓冲液每次都要新配，大槽的可以重复使用）；取5ul 彩色预染蛋白marker于上样孔内，吸取一定量的蛋白样品于上样孔内，未加样孔加入20 μl电泳缓冲液用以平衡（这一步我会在加完蛋白样品后，再剩余空内再加一遍蛋白样品，这样跑完电泳后可以把这部分的蛋白切下来考染，看看蛋白有没降解）；积层胶60 V电压下0.5 h，分离胶120 V电压下1.5 h，当观察到marker跑开后即可以更换电压（电压和时间视胶跑的情况而定，电泳时用稳压）；
5切胶及转膜（湿转）
在加有电转液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、六张滤纸和浸过甲醇15s左右的膜。
将玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，
切下用于考染的胶，放入考马斯亮蓝里头，放于摇床37℃，4h（考马斯亮蓝可反复使用，4h后将胶取出脱色，可以按照网上搜索到的脱色方法。
我自己做的时候是直接用双蒸水冲洗下胶，再浸在双蒸水里，一段时间后蓝色褪掉一些就可以看到蛋白电泳的情况了。
这样就省去了配脱色液，逐步脱色这些烦人的步骤了）。
剩下的胶先放在上述搪瓷盘里。
按照胶的大小裁剪滤纸跟膜的大小，三者大小应是相同的。
将夹子打开使白的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫2-3层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
小心将分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。
在膜上盖三张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下合起夹子。
将夹子放入转移槽槽中转膜中，夹子白色那面对应负极（黑色），黑色那面对应正极（红色）。
转膜用稳流200mA 1h（这个条件可以将β-actin 跟17KD的目的蛋白同时转过去）。
转完后将膜用甲醇过一下，几秒即可，丽春红染液染5 min。
然后用双蒸水冲洗掉染上的染液，看到膜上需要的蛋白条带，即可说明转膜成功。
将膜用双蒸水洗干净，正常情况下可以恢复膜原来白色的样子。
而后将膜晾干备用（丽春红染液可反复使用）。
6封闭及杂交
将膜用TBST漂洗，浸于封闭液中在摇床上摇荡1-2 h。
制作一塑料薄膜小口袋，将膜从封闭液中取出，放入小口袋，加入一抗，4℃过夜，一抗孵育结束后，用10ml TBST浸洗3次，每次10 min；根据一抗来源选择适合二抗，按相应比例稀释，室温下轻摇1-2 h；二抗孵育结束后，用10ml TBST浸洗3次，每次10 min。
7 显色及显影及结果判断
将A液和B液1：1混合，覆盖在膜表面，在暗室中观察，当有荧光时，将膜放在玻璃板上，用保鲜膜将膜和板包起，放入片夹中；在暗室中将X光片覆盖在膜上面，曝光时间为根据荧光强度调整，如β-actin很亮时曝光5s左右,目的蛋白亮度跟β-actin一样亮时7-8s,一半亮时20s左右，具体时间根据实际情况调整。
显影到看到条带出现，即放入水中清洗下，在放入定影液中1min，再用清水清洗下，晾干（使用过程中主要显影液要及时更换）。
Image scanner成像系统扫描蛋白条带，用Quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。
