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微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
一、实验目的1. 探讨不同防腐剂对食品的防腐效果；2. 评估不同防腐剂在食品中的应用前景；3. 为食品防腐提供理论依据。
二、实验材料1. 实验原料：鲜鸡蛋、食盐、糖、柠檬酸、山梨酸钾、苯甲酸钠、脱氢乙酸；2. 实验仪器：电子天平、恒温培养箱、显微镜、无菌操作台等；3. 实验试剂：无菌生理盐水、无菌滤纸、无菌培养皿等。
三、实验方法1. 鲜鸡蛋处理：将鲜鸡蛋洗净，去壳，分成5组，分别标记为A、B、C、D、E组，每组鸡蛋50个；2. 防腐剂添加：A组鸡蛋不添加任何防腐剂，作为对照组；B组鸡蛋添加0.5%食盐；C组鸡蛋添加0.5%糖；D组鸡蛋添加0.1%柠檬酸；E组鸡蛋添加0.1%山梨酸钾；3. 分组培养：将处理好的鸡蛋放入无菌培养皿中，置于恒温培养箱中，温度为37℃，培养时间为7天；4. 观察记录：每天观察鸡蛋的腐败情况，并记录数据；5. 统计分析：对实验数据进行统计分析，比较不同防腐剂的防腐效果。
四、实验结果与分析1. 对照组（A组）：在培养过程中，鸡蛋逐渐出现腐败现象，如变黄、变臭等；2. B组（食盐）：在培养过程中，鸡蛋的腐败速度明显减缓，腐败现象较轻；3. C组（糖）：在培养过程中，鸡蛋的腐败速度减缓，但腐败现象较B组稍重；4. D组（柠檬酸）：在培养过程中，鸡蛋的腐败速度减缓，腐败现象较轻；5. E组（山梨酸钾）：在培养过程中，鸡蛋的腐败速度明显减缓，腐败现象最轻。
根据实验结果，可以得出以下结论：1. 食盐、糖、柠檬酸、山梨酸钾等防腐剂对鲜鸡蛋具有一定的防腐效果；2. 山梨酸钾的防腐效果最好，其次是柠檬酸、食盐、糖；3. 食盐、糖、柠檬酸、山梨酸钾等防腐剂在食品防腐中具有较好的应用前景。
五、实验讨论1. 本实验选取了食盐、糖、柠檬酸、山梨酸钾等常见的防腐剂进行实验，结果表明这些防腐剂对鲜鸡蛋具有一定的防腐效果；2. 在实际应用中，应根据食品的特性、防腐剂的作用机理和安全性等因素，选择合适的防腐剂；3. 本实验结果表明，山梨酸钾的防腐效果最好，但应注意其使用量，避免对人体产生不良影响；4. 食盐、糖、柠檬酸等防腐剂在食品中的应用较为广泛，但应注意其过量使用可能对食品口感、营养价值等方面产生不利影响。
防腐实验方案摘要：防腐是一种广泛应用于工业领域的技术，旨在防止物体受到腐败和化学反应的影响。
本文介绍了一个简单的实验方案，以研究不同材料在不同环境条件下的防腐性能。
该实验将探讨材料的防腐性能与温度、湿度和腐败源的接触时间之间的关系，并提供了一些实验步骤和数据分析方法，旨在帮助读者更好地了解和评估防腐技术的应用。
1. 引言防腐是一种重要的技术，广泛应用于许多行业，包括建筑、航空、汽车、船舶以及金属和木材加工等领域。
防腐的目标是延长材料的寿命，减少维护和更换成本，并保护物体免受腐败和化学反应的影响。
因此，在研究和开发新的防腐技术时，实验是一种非常重要的手段。
2. 实验目的本实验旨在通过研究不同材料在不同环境条件下的防腐性能，评估和比较不同材料的防腐特性。
具体目标如下：- 调查温度、湿度对不同材料防腐性能的影响。
- 探讨不同材料与腐败源接触时间对防腐性能的影响。
- 分析和比较各种材料的防腐性能。
3. 实验材料与设备- 材料：选取不同种类的材料进行实验，如金属、塑料、木材等。
- 设备：实验箱、温控器、湿度计、腐败源（如盐水溶液）、计时器、天平等。
4. 实验步骤1) 准备工作：a. 准备不同材料的样品，确保样品形状和尺寸相似。
b. 调节实验箱的温度和湿度，使其符合实验要求。
c. 准备腐败源，例如盐水溶液。
2) 实验组设计：设置几个实验组，每个实验组的材料和环境条件都不同。
例如，可以设置以下实验组：a. 实验组1：金属样品在高温高湿环境中与腐败源接触一段时间。
b. 实验组2：塑料样品在低温高湿环境中与腐败源接触一段时间。
c. 实验组3：木材样品在常温常湿环境中与腐败源接触一段时间。
3) 样品处理：将样品放置于不同实验组的实验箱中，确保样品与腐败源充分接触。
设定一定的接触时间，例如24小时。
4) 数据记录：a. 记录不同实验组的温度和湿度。
b. 记录材料样品在腐败源中接触的时间。
c. 定期记录样品的质量变化情况。
防腐挑战性实验规程一、目的本方法及标准摘自欧盟标准BP2002 XVIC EFFICAIY OF ANTIMICROBIAL PRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。
二、材料及工具1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）；2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水；3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基；4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。
三、步骤1.标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。
2.细菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
3.霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。
5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。
化妆品防腐性能挑战性试验及评价标准化妆品防腐挑战性试验及评价标准投产前对产品防腐体系的可靠性做效能测试是十分必要的，目前，国内外配方设计时普遍采用防腐挑战性试验评价防腐剂的有效性。
防腐挑战性试验更接近实际应用，该方法能够模拟化妆品生产和使用过程中受到高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适宜条件，从而避免由微生物污染造成的损失和为消费者健康提供可靠的保证。
1.CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g(ml)和1000000cfu/g(ml)(CFU为菌落单位)，要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。
美国在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准，即，若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100 cfu/g(ml)以下，28天全部为0，则视为效果优良通过挑战试验;若第七天时下降到1000 cfu/g(ml)以下，则视为勉强通过;若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求，防腐体系则评定为无效。
2.国内参照CTFA加菌防腐挑战性试验及评价标准初始接种细菌量1000000 cfu/g(mL)(1)第28天时，样品中含细菌或霉菌,1000cfu/g(mL)该样品不能通过微生物攻击的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地志到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。
(2)第28天时，样品中含细菌或霉菌在100 cfu/g-1000 cfu/g(mL)，该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防霉体系可以使用，否则不能。
(3)第28天时，样品中含细菌或霉菌在10 cfu/g-100 cfu/g(mL)，表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时不容易受到微生物污染。
防腐挑战测试标准(一)防腐挑战测试是指在特定环境条件下对涂层的耐腐蚀性能进行测试。
这种测试可以帮助生产商评估并改进涂层的性能。
以下是防腐挑战测试的标准。
ASTM B117-16ASTM B117-16标准是一项针对盐雾腐蚀的测试。
该测试要求将待测试试样放入含有5%盐度的盐水中，在特定的环境条件下进行测试，测试时要记录样品在盐雾环境中的腐蚀情况。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在盐雾环境下的使用。
ISO 9227ISO 9227是一项针对雾露腐蚀的测试。
这项测试要求在特定的温度和湿度条件下，将试样放置在压水式雾露设施中，然后观测样品的腐蚀情况。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在潮湿或有雾露的环境下的使用。
ASTM D4585-16ASTM D4585-16是一项针对氙灯老化的测试。
该测试要求将待测试试样放入氙灯光源下进行测试，测试时间取决于试样材料和预测的使用条件。
该标准可以帮助企业确定涂层在室外光照环境下的耐久性。
ASTM G85-11ASTM G85-11是一项针对盐雾、酸雾和湿热环境的测试。
该测试要求将待测试试样放入盐雾、酸雾或湿热环境中，根据试样材料、使用条件和预期寿命等别进行不同时间的测试。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在恶劣环境下的使用。
结论通过使用这些防腐挑战测试标准，企业可以确定其涂层的性能，以便改进涂层的配方和应用。
这些测试标准可以确保产品在使用寿命内能够表现出所需的耐腐蚀性能。
其他防腐挑战测试标准除了以上提到的标准，还有一些其他的防腐挑战测试标准可以用于评估涂层的性能，如：•ASTM D2247-15，是一项针对热循环腐蚀的测试，要求将试样在高温和低温之间循环进行测试。
•ASTM D4329-13，是一项针对紫外线老化的测试，要求将试样暴露在紫外线光源下进行测试。
•ISO 20340-2017，是一项针对海水腐蚀的测试，要求将试样放置在海水环境中进行测试。
这些标准都是在特定的条件下对涂层的耐腐蚀性能进行测试，可以帮助企业了解涂层在不同环境中的表现。
摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。
关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。
因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。
1 化妆品的防腐体系化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。
防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。
1.1化妆品防腐剂早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。
这些防腐剂至今很多仍在使用。
近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。
至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。
防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。
表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。
表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分商品名称化学成分Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇Biopure100 咪唑烷基脲Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲Nipacide PX (PCMX) 对氯间二甲苯酚GERMALLⅡ双咪唑烷基脲GERMALL PLUS 双咪唑烷基脲和碘丙炔基氨基甲酸丁酯（IPBC）ALLANTOIN 乙醛双酰脲SUTTOCIDE A 羟甲基甘氨酸钠华科-98、凯松CG、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-2甲基-4-异JX-515、YN-H3 噻唑啉-3-酮GLYDANT 二甲基二羟基乙内酰脲GLYDANT PLUS DMDM和IPBCIRGASAN DP300（玉洁新DP-300）、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚Oletron1.2化妆品的防腐体系的构建1.2.1防腐剂的复配一种万能的防腐剂是不存在的。
（原创实用版5篇）编制人员:_______________审核人员:_______________审批人员:_______________编制单位:_______________编制时间:____年___月___日序言下面是本店铺为大家精心编写的5篇《iso11930 防腐挑战试验方法》，供大家借鉴与参考。
下载后，可根据实际需要进行调整和使用，希望能够帮助到大家，谢射!（5篇）《iso11930 防腐挑战试验方法》篇1ISO 11930是关于防腐挑战试验的标准，该标准规定了评估在腐蚀性介质中材料耐久性的方法。
ISO 11930提供了一种系统的方法，用于确定材料在各种腐蚀性环境中的耐久性，包括均匀腐蚀、局部腐蚀和其他类型的腐蚀。
ISO 11930包含以下主要部分：1. 第一部分：概述和试验原理2. 第二部分：试验方法3. 第三部分：结果评价ISO 11930标准已被许多国家所接受，并被许多国际组织所引用。
在中国，该标准由国家质量监督检验检疫总局于2004年5月17日发布，并于2004年12月1日开始实行。
《iso11930 防腐挑战试验方法》篇2ISO 11930是关于防腐挑战试验的标准，该标准规定了评估在腐蚀性环境中使用的防护等级和涂层在预期使用条件下防腐性能的标准试验方法。
ISO 11930通过模拟实际使用条件，如高温、低温、湿热、干湿交替等，来评估产品的防腐性能。
这些条件可以模拟海洋、河流、湖泊和河流等水环境中常见的腐蚀性条件。
在进行ISO 11930试验时，需要将样品暴露于这些条件下，然后观察其表面和内部的腐蚀情况。
根据观察结果，可以评估产品的防腐性能，并确定其是否符合标准。
《iso11930 防腐挑战试验方法》篇3ISO 11930是关于防腐挑战试验的国际标准，该标准由国际标准化组织于1999年发布。
该标准规定了用于评估材料在特定环境条件下耐腐蚀性能的试验方法。
ISO 11930提出了以下步骤来进行防腐挑战试验：1. 准备试样：选择适当的材料（如不锈钢、铝、铜等）制成试样。
钢铁防腐实验报告实验目的本实验旨在研究不同钢铁表面防腐处理方法对其耐腐蚀性能的影响，为工业领域中的钢铁材料选择合适的防腐处理方法提供依据。
实验步骤1. 材料准备•实验所需材料包括钢铁样品、酸碱溶液、防腐涂料和试验设备等。
•钢铁样品选择具有代表性的不同种类，如镀锌钢板、不锈钢板等，每种材料选取多个样品。
•酸碱溶液的浓度和种类根据实验要求确定。
•防腐涂料选择几种常用的类型。
2. 钢铁表面处理•每个钢铁样品在进行防腐处理之前，需进行清洗和脱脂，以确保表面没有杂质和油脂。
•清洗完成后，可以选择进行表面打磨或除锈工序，以保证表面平整和清洁，便于后续处理。
3. 防腐处理针对不同样品和不同防腐涂料，采用不同的防腐处理方法，具体步骤如下： - 涂刷法：使用刷子或喷枪将防腐涂料均匀地涂刷在钢铁表面，确保整个表面都被覆盖。
- 浸泡法：将钢铁样品完全浸入防腐涂料中，保持一定时间后取出，待涂料干燥。
- 染色法：将防腐涂料与染色剂混合，将钢铁样品浸泡其中，确保涂料与金属表面充分接触。
- 热浸镀法：将钢铁样品先进行酸洗处理，然后在预热的镀液中将其浸泡一定时间，形成镀层。
4. 实验条件在进行实验时，需要控制以下条件： - 温度：实验室温度保持稳定，并根据实验要求进行调整。
- 湿度：控制实验环境的湿度，以保证实验条件一致。
- 时间：针对不同的防腐处理方法，设置不同的处理时间。
5. 实验测量•处理完成后，测量每个样品的尺寸和重量，记录下来作为后续分析的依据。
•可选地，进行表面粗糙度测量，以了解防腐处理对钢铁表面的影响。
6. 腐蚀测试•将经过不同防腐处理的钢铁样品，置于具有腐蚀性质的酸碱溶液中，模拟实际使用环境的腐蚀情况。
•每个样品在溶液中浸泡一定时间后取出，进行外观检查和测量，记录下来。
•根据实验要求，可以进行附着力测试等实验，评估防腐涂层的性能。
实验结果钢铁表面处理效果•根据对样品的表面观察，清洗和脱脂步骤可以有效去除杂质和油脂，提高防腐涂层的附着力。
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g2微生物挑战性实验2.1实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。
（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株菌株美国（药典）美国（ISP公司）英国（药典）德国（Henkel 公司）德国（S&M公司）白假丝酵母V V V V V 黑曲霉V V V V V 红色青霉V绿色木霉V绳状青霉V 大肠埃希氏菌V V V V 镉绿假单胞菌V V V V 金黄色葡萄球菌V V V V V 粪肠球菌V产气肠杆菌V表皮匍萄球菌V 日勾维肠杆菌V洋葱假单胞菌肺炎克雷伯氏菌恶臭假单胞菌荧光假单胞菌表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌至少选一种发酵革兰氏阴性杆菌表皮匍萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌至少选两种非发酵革兰氏阴性杆菌变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌至少选一种酵母恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母至少选一种霉菌近平滑假丝酵母黑曲霉至少选一种产芽孢菌黄绿青霉枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株—种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基2.3 试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3x108cfu/ml, 此悬液再做3 倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。
将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3X 10f^cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1X 108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。
2微生物挑战性实验2.1 实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示），所以更为恰当。
（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株美国美国英国德国德国菌株(药典 ) (ISP 公司 ) (药典 ) (Henkel 公司 ) (S&M 公司 ) 白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√绿色木霉√绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√产气肠杆菌√表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌至少选一种表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母酵母至少选一种近平滑假丝酵母黑曲霉霉菌至少选一种黄绿青霉产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基2.3 试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。
将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3× 108cfu/ml ）相同为止；此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
（3）霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在190～ 210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
2.4 接种2.4.1 接种方式（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。
这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。
（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。
2.4.2 接种次数和时间28 天。
（一次加菌（ 1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期的 28 天微生物挑战实验）（ 2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）a 法：第 21 天再接种一次，试验周期为28 天。
（有实验表明，第21 天接菌和不接菌时，第28 天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第1、 3、 5 周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为 49 天；c 法：每周接种一次，连续 5 次，试验周期为35 天。
（S&M 公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30 个月内的防腐安全）2.4.3 操作方法称取待测样品30g，对应加入 0.3ml 浓度为 1×107～1×108 cfu/ml 的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5± 2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5± 2.5℃的培养箱中培养。
a.水溶性样品10g 加入90ml 无菌生理盐水，稀释后取1ml 样品液，加入9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为 10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、 10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取 1ml 样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
b.油溶性样品取 10g 样品，加入 10ml 无菌吐温 -80 和 10ml 无菌白矿油，再加70ml 无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；吸取 1ml 已稀释的样品液，加入 9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取 1ml 加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
2.5 培养细菌放在 32.5±2.5℃的培养箱中培养；霉菌在 22.5± 2.5℃的培养箱中培养；混合菌在 28℃的培养箱中培养。
2.6 菌落计数分别在 0、7、14、 21、28 天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。
菌落计数的标准方法：①先选取平均菌落数在30～300 之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～ 50 之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；②有两个稀释度在30～300 之间，求比值。
若比值≤2，报告平均数；若比值 >2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；⑤所有稀释度均在30～300 之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于 30，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数计算；⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后× 2，以报告全皿菌落数。
2.7 评价标准2.7.1 CTFA 推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA 的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ ml ）和1000000cfu/g（ ml）（CFU 为菌落单位），要求在第 7 天时霉菌降低 90%，细菌降低 99.9%，并且在 28 天内菌数持续下降。
2.7.2 美国评价标准在 CTFA 评价方法的基础上提出的标准，如表 3 所示。
表 3 美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的 28 天微生物挑战实验防腐效果优良若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到 100 cfu/g （ ml）以下，第28 天全部为 0。
防腐效果勉强通过若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到 1000 cfu/g （ ml ）以下。
防腐效果无效若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到 CTFA 的要求。
2.7.3 国内评价标准国内参照 CTFA 加菌防腐挑战性评价标准。
表 4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的 28 天微生物挑战重复加菌的微生物挑战实验实验防腐效果优良（ W ）第 28 天化妆品中存货的细菌在三次加菌后，在每次加菌的数量 <10CFU/ml ，说明该样品第 14 天样品中存货的细菌数防腐体系对细菌有较强的抑<100CFU/ml杀效果。
防腐效果尚可（ M ）第 28 天化妆品中存货的细菌在三次加菌后，在每次加菌的数量 <100CFU/ml ，说明该样第 14 天样品中存货的细菌数品防腐体系对细菌有一定的<1000CFU/ml抑杀效果。
防腐效果差（ P）第 28 天化妆品中存货的细菌在三次加菌后，在每次加菌的数量 >100CFU/ml ，说明该样第 14 天样品中存货的细菌品防腐体系对细菌有较差的数 >1000CFU/ml抑杀效果。
第二部分实验室可采取的方案1实验样品2微生物挑战性实验2.1 实验菌株金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基2.3 试验用菌液的配置实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。
细菌培养 2 天，霉菌培养 5 天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（ 10^8CFU/ml ）和霉菌悬液（ 10^6CFU/ml ），置于 4℃冰箱储藏备用。
2.4 一次加菌的28 天微生物挑战实验量取样品30ml 分别加 0.3ml 混合菌悬液，使得细菌浓度为10^6~10^7CFU/ml ，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml ，充分混匀。
将样品在28 摄氏度下保存，在接菌0、 7、 14、 21、28d 取样品分析含菌量（培养计数法）。
2.6 评价标准评价标准一次加菌的 28 天微生物挑战实验防腐效果优良（ W ）第 28 天化妆品中存货的细菌数量<10CFU/ml ，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。
防腐效果尚可（ M ）第 28 天化妆品中存货的细菌数量<100CFU/ml ，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。
防腐效果差（ P）第 28 天化妆品中存货的细菌数量>100CFU/ml ，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。
附：实验中所需的仪器和药品设备名称需求数量要求用途1 冰箱 1 易清洁消毒存放菌种、标准悬液2 电子秤 1 易清洁消毒样品重量测试3 浊度仪 1 易清洁消毒检测细菌菌悬液之浓度4 无菌操作台 1 易清洁消毒微生物实验用，要求等级 10000 级5 生化培养箱 3 易清洁消毒细菌、霉菌培养各 1 台；保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用 1 台6 显微镜 1 易清洁消毒霉菌总数观测用7 移液枪 2 100~1000 uL 移取菌液用；备用8 恒温水浴锅 1 易清洁消毒用于油性样品之充分溶解，规格待定9 自动灭菌锅 1 自动物品灭菌用10 牛角勺100 称取样品用；备用11 酒精灯 2 无菌操作台配套用；备用12 200ml 烧杯10 盛装样品用；备用13 500ml 烧杯10 盛装样品用；备用14 150ml 10 盛装样品用；备用三角烧瓶15 10ml 试管100 配备塞子盛装无菌生理盐水；备用16 移液枪枪尖100 移液枪配套用；备用17 培养皿200（套）细菌、霉菌总数测定用；备用18 血细胞计数板 2 霉菌计数用；备用19 革兰氏染色 1 革兰氏染色用配套盒20 普通营养琼脂10 瓶装自配培养基用；备用21 虎红琼脂10 瓶装自配培养基用；备用22 氯化钠 2 分析纯自配生理盐水用；备用23 硫酸 1 分析纯用于配置标准悬液24 氯化钡 1 分析纯用于配置标准悬液25保鲜膜2保存样品用；备用。
