小鼠组织冰冻包埋

小鼠肝组织保存方法引言小鼠肝脏是常用的研究对象之一，其重要性在于其参与了多种重要的生理功能和代谢途径。

因此，保存好小鼠肝组织对于科学研究尤为重要。

本文将介绍几种常用的小鼠肝组织保存方法，供科研人员参考。

冷冻保存法冷冻保存是一种常用的小鼠肝组织保存方法。

具体步骤如下：1. 将小鼠肝脏组织切割成适当大小的块状；2. 将切割好的肝组织块放入冷冻管中；3. 加入足够量的冷冻保护剂（如甘油、DMSO等）；4. 快速冷冻至-80摄氏度或更低的温度；5. 将冷冻管密封，存放在冷冻库中。

冷冻保存法的优点是保存简单、损伤小鼠肝组织少，同时也可保存较长时间。

但是，冷冻保存可能会引起细胞膜的破坏和冷冻刀割伤害，需要注意冷冻保护剂的选取和冷冻速度的控制。

液氮保存法液氮保存是一种更加常用的小鼠肝组织保存方法。

具体步骤如下：1. 将小鼠肝脏切割成适当大小的块状；2. 将切割好的肝组织块放入液氮中；3. 快速冷冻至-196摄氏度；4. 将冷冻的肝组织块存放在液氮罐或液氮槽中。

液氮保存法的优点是保存时间长、对细胞损伤小、保存稳定。

但是，液氮保存需要专门的设备，并且在保存和取样时需要注意安全操作，以防止液氮的危害。

离心冻干保存法离心冻干保存法是一种较为复杂但保存时间较长的小鼠肝组织保存方法。

具体步骤如下：1. 将小鼠肝脏切割成块状；2. 将切割好的肝组织块放入冷冻管中；3. 加入足够量的离心冻干保护剂（如蔗糖）；4. 在低温下进行离心冻干，通常为-40摄氏度下进行离心14-18小时；5. 将冻干后的肝组织块密封，存放在低温干燥的条件下（如-20摄氏度）。

离心冻干保存法适用于长期保存，其优点是保存时间长，保存过程中有保护剂的存在，冻干后的小鼠肝组织较为稳定。

但是，离心冻干保存法需要专业的设备和较长的时间。

液氨保存法液氨保存法是一种相对较为新的小鼠肝组织保存方法。

具体步骤如下：1. 将小鼠肝脏切割成适当大小的块状；2. 将切割好的肝组织块浸泡在液氨中；3. 快速冷冻至-40摄氏度以下；4. 将肝组织块转移到液氮中保存。

2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤）冰冻切片操作方法及步骤：1取材：(昆明小鼠各个组织或器官)取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

2包埋：取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。

3修平：将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。

4切片：调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

5调防卷板：制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。

这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。

冰冻切片时的注意事项：1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。

有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。

因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。

临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。

石蜡包埋（小鼠脑组织）第一天：固定，取材当天即把所需包埋的组织（取出后放入4%的多聚甲醛中过夜（12h）；第二天：冲水，12小时（注意水流不需要太大，不可将水流直接冲击组织）脱水，60%酒精4h白天（或者60%酒精4℃过夜12h）→第三天：→70%酒精4h→80%酒精4h→90%酒精4h→95%酒精4℃过夜(不一定12小时)→第四天：→100%酒精Ⅰ2h→100%酒精Ⅱ2h→100%酒精Ⅲ2h→透明，二甲苯Ⅰ5+3min→二甲苯Ⅱ5+3min→二甲苯Ⅲ5+3min→二甲苯Ⅳ3+2min→（此处注意，在透明过程进行到此处时，应在浸完后拿出脑组织观察一下透明是否彻底，一般来说透明完全的脑组织是呈现为一个通体琥珀状，如果是发现脑组织内部仍呈现不通透的白色则继续酌情追加浸泡（透明）时间）浸蜡，软蜡Ⅰ2h→软蜡Ⅱ2h→软蜡Ⅲ2h→中蜡包埋备注：1、软蜡是指熔点48-50℃的石蜡，中蜡是指熔点58—60℃的石蜡。

在包埋前应该提前将各种蜡准备好，放在对应的蜡缸里融好，注意不要加热太长时间。

待蜡完全融好后关上煤气，冷却至烧杯上沿不是太烫手且蜡也未凝固是将蜡挪到６０℃温箱里备用。

在融蜡时要注意通风橱使用规范。

2、包埋组织块时要注意动作熟练紧凑，时间过长就会导致蜡温不够，影响包蜡质量。

放组织块时要注意切面一定要放正确，待切的面朝向包埋铁框面。

包埋时勿将气泡带入。

可以稍微倾斜一些放置塑料包埋框。

3、酒精串缸结束后，可以将组织拿出一部分出来观察一下是否切面平整，是否厚薄一致，以免影响透明的整齐度，导致组织透明的时间不一致。

４、酒精串缸结束后，把包埋盒用滤纸尽量弄干，然后再往二甲苯中放。

5蜡块包埋完成后不要急于挪动，待蜡块凝固后再将蜡块放到－２０℃冰箱里冷藏10ｍｉｎ，以利于将铁框和包埋盒分离。

1.取材固定:离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散。

固定就是加入一些可以让蛋白质变性的物质(比如说甲醛)，使得蛋白质的结构被固定住，不再发生变化，同时也不会再发生一些活性反应，这样才好做后续的染色步骤。

常见固定液是4%的多聚甲醛和饱和苦味酸。

根据不同目的、组织特征代表性取材。

取的材料应该小而薄。

便于固定剂迅速渗入内部，一般厚度不超过2mm，大小不超过5X 5mm"。

每个组织最好多切几块。

新鲜组织固定(组织块不宜太大太厚，这样固定液很难进入里面，可能会导致在较短的时间内脱水不完全，引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。

组织块也不能太小，否则不能保证切片数量，且透明时间和浸蜡时间不能很好的把握。

)固定时间因固定剂种类而异，大多6-12 小时，一般不超过12小时。

视组织固定的难易程度而定。

后续如果做免疫组化，不应超过12小时;后续如果做HE染色，不应超过24小时。

固定完之后用水洗(目的:洗去渗入组织的固定液，终止固定以免影响对组织的内结构的观察，分析。

换液两次，一次半小时。

) 之后可直接脱水包埋或放入75%的乙醇4度可长期保存。

2.脱水从75%的乙醇中取出，分别放到80%，90%，100%( I )的乙醇中30min，再放入100%乙醇中。

固定完直接水洗包埋的，应从70%乙醇开始，易碎组织从50%乙醇开始。

组织脱水时间不应过长，尤其是高浓度乙醇，要特别注意控制时间。

3.透明透明的目的是置换组织内的脱水剂，为下一步浸蜡起到桥梁作用，二甲苯可以去除脂肪。

乙醇+-二甲苯(1:1) 2h；二甲苯(I )，二甲苯(II)各10min(根据组织的大小和透明的难易程度不同，透明的时间可以根据具体情况调整。

颜色浅的组织表面油亮，可以透过光时效果较好，颜色较深的组织至少边缘可以透光。

)4.浸蜡浸蜡目的是置换组织中的透明剂，为包埋作准备。

二甲苯+石蜡(1:1)2h；石蜡(I)1h;石蜡(II)2h.(浸蜡的时间也可以长一些)5.包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡(最好提前4小时以上开始融蜡，新蜡更难融)，倒入蜡盒(可以浸没组织就行，大约蜡盒的三分之一)由于蜡盒底部与冰盒接触，底部的蜡会先凝固，这样就可以把组织用镊子夹住立在底部。