PBMC分离与冻存

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。

其中淋巴细胞占很大一部分。

分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。

否则将分层混乱。

步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。

此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。

pbmc离心条件PBMC离心条件PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的简称，它是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞等。

离心是一种常见的分离技术，可以将PBMC从外周血中分离出来。

离心条件对于PBMC的纯度和活力至关重要。

本文将详细介绍PBMC离心条件的相关内容。

一、离心设备选择在PBMC离心过程中，常用的离心设备有离心管、离心机和离心离心管。

离心管是最常用的离心设备，适用于小规模的离心。

离心机则适用于大规模离心，可以同时离心多个样本。

离心离心管则是一种专门用于离心PBMC的设备，其设计使得PBMC可以在离心过程中得到更好的保护，减少损伤。

二、离心速度和时间离心速度和时间是影响PBMC离心效果的重要因素。

一般来说，离心速度越高，离心时间越长，可以得到更纯的PBMC。

但是过高的离心速度和时间也会对PBMC造成损伤，影响其活力。

因此，在选择离心速度和时间时，需要根据具体实验要求和离心设备的要求进行调整。

三、离心温度和离心液离心温度和离心液对于PBMC的离心效果也有重要影响。

一般来说，较低的离心温度可以保护PBMC的活力，常用的离心温度为4摄氏度。

离心液的选择也要根据实验需要进行调整，常用的离心液有PBS、Ficoll等。

离心液的选择应考虑其密度梯度和对PBMC的影响。

四、离心后的处理离心后，需要对分离得到的PBMC进行进一步的处理。

常见的处理方法包括洗涤、冻存和培养。

洗涤可以去除离心液和杂质，保证PBMC的纯度。

冻存可以将PBMC保存起来，以备后续实验使用。

培养可以使PBMC在适当的条件下继续生长和增殖。

总结：PBMC离心条件对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。

合理选择离心设备、调整离心速度和时间、控制离心温度和离心液，以及适当处理离心后的PBMC，都是保证离心效果的关键。

只有在严格控制离心条件的前提下，才能得到高质量的PBMC，为后续的实验提供可靠的基础数据。

人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。

PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。

为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。

一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。

2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。

3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。

二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。

2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。

3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。

三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。

2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。

3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。

对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。

刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。

2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。

3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。

4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。

6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。

7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。

①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。

②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。

细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。

（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。

9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。

（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。

10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。

11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。

以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。

•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。

•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。

3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。

•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。

•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。

4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。

5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。

6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。

•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。

注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。

•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。

•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。

这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。

刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。

2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。

3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。

4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。

6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。

7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。

①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。

②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。

细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。

（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。

9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。

（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。

10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。

11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

冻存PBMC单细胞转录组一、介绍冻存PBMC单细胞转录组是一种用于研究人类外周血单个细胞的转录组学特征的方法。

PBMC（外周血单个核细胞）主要由淋巴细胞（包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞）和单核细胞（包括单核巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞前体细胞）组成。

通过冻存和单细胞RNA测序技术，我们可以获得每个单个核细胞的全转录组数据，进而深入了解每个细胞的转录组学特征。

二、冻存PBMC单细胞转录组实验步骤2.1 PBMC样品的采集和处理1.从志愿者的外周血中提取血液样品。

2.使用Ficoll-Paque离心管将血液样品首次离心。

3.耐心地将上清液转移到新的离心管中。

4.再次使用Ficoll-Paque离心管进行离心操作，以分离PBMC。

5.用PBS缓冲液洗涤PBMC。

6.去除细胞离心沉淀。

2.2 PBMC单细胞的冻存和保存1.向PBMC悬浮液中加入同等体积的冻存保护剂。

常见的冻存保护剂包括10%DMSO（二甲基亚砜）和90%血清。

2.缓慢冷却PBMC悬浮液。

可以使用特殊的冷冻工具或液氮计算机控制的冷却器。

3.将冷冻PBMC样品转移到液氮罐中，保存在-80°C或液氮中。

三、冻存PBMC单细胞转录组的意义冻存PBMC单细胞转录组在疾病诊断、药物研发和基础研究中具有重要意义。

3.1 疾病诊断通过比较健康个体和疾病患者的PBMC单细胞转录组数据，我们可以发现不同于正常样本的基因表达模式。

这些差异可能是疾病发展的指标和潜在的靶点，有助于疾病的早期检测和诊断。

3.2 药物研发PBMC单细胞转录组可以用于评估药物的疗效和毒性。

通过将PBMC暴露于药物后，我们可以观察到基因表达的变化，从而判断药物对细胞的影响。

这有助于筛选出具有治疗潜力的药物候选物，并提供药物的个体化治疗策略。

3.3 基础研究PBMC单细胞转录组对于探究免疫系统的发育、功能和调节机制至关重要。

通过分析不同细胞亚群的转录组数据，我们可以了解它们在免疫反应中的作用和相互关系。

提PBMC步骤（留血浆）
实验前准备：提前30 min开紫外灯，从冰箱拿出淋巴细胞分离液（使其温度升至室温）
1.离心，3000 r/15 min;
2.轻轻取出，将血浆吸入EP管（DEPC水泡过的），标记，-80 ℃冻存；
3.向抗凝管中加入PBS至5 ml，混匀；
4.取离心管，加入6 ml左右的淋巴细胞分离液，与血样1:1-1:2。

将血样缓慢加
入离心管液面上；
5.离心，1700 r/15 min；
6.轻轻取出，提取中间薄薄的一层乳白色细胞于离心管中；
7.向离心管中加入PBS至满管；
8.离心，2000 r/8 min；
9.轻轻取出，将离心管中的液体全部倒入废液烧杯，加TRIzol 800-1000 ul, 反
复吹打，混匀；
10.将离心管中液体转移至EP管中，标记，-80 ℃冻存。

ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。

本文件由中国医药生物技术协会归口。

本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。

本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。

88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。