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通过大孔树脂柱层析和制备HPLC分离和纯化竹叶中具有抗氧化活性的4种C-糖苷黄酮摘要：目前已研究了4种C-糖苷黄酮，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的制备方法,而这些C-糖苷黄酮是从乙醇提取物水溶液(即竹叶抗氧化物AOB)里通过AB-8大孔树脂和制备HPLC(流动相:10%和15%(V/V)/1%醋酸)制得的。
近而通过用甲醇和水分别作为抗溶剂和盐析剂的结晶法来纯化得到这些C-糖苷黄酮。
纯度是由分析HPLC谱图来估算的，而化学结构的确定是由IR，MS,NMR和UV谱图来确定的。
由5LAOB浓缩液得到的6.5g原料柱层析部分制得了荭草苷（49mg）、异荭草苷（142mg）、牡荆苷(15mg)、异牡荆苷(62mg)。
这些方法比较适用于制备纯C-糖苷黄酮的可利用的量，也适用于在竹叶中的荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的量。
关键词：C-糖苷黄酮；大孔树脂；制备HPLC；结晶作用；竹叶抗氧化物1.简介在生物学上，二级植物代谢物是有活性的与人体的蛋白质有关联的非营养物。
黄酮——植物多酚二级代谢物的一大类——广泛分布于药草、果实、茶叶等中。
黄酮，存在于人类的食物中，对人体健康产生了特殊的作用，包括抗氧化活性，心脏血管疾病的防治，癌症的预防等。
C-糖苷黄酮是黄酮家族的一个重要的一类，在一些植物中被发现，例如，紫檀树和葫芦科果实中。
C-糖苷黄酮的多种生物活性已被报道过，包括异荭草苷（毛地黄黄酮-6-糖苷）和牡荆苷（芹菜素-8-糖苷）的抵抗金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，绿脓杆菌的抗菌活性，也包括毛地黄黄酮-7-糖苷对于抵抗由CCl4引起的肝伤。
竹叶抗氧化物（AOB）是一种从竹叶中提取出来的灰褐色粉末，能够阻碍液体自动氧化的链反应，这种自动氧化会螯化过渡态的金属离子，净化亚硝酸化合物和阻碍亚硝胺的合成，另外，AOB已被证明对于过渡金属离子和自由基（包括在体外的高分子的衰减）具有强的抗氧化活性和抑制功效。
在中国，AOB已被证明是一种新的食物抗氧化剂，它能够被加进疏松的食品，水产品，肉类，可食用油，谷类，面包，水果及蔬菜汁，茶饮料和油炸食品中，这些都已经过中国卫生部门认证。
大孔树脂的吸附操作过程与注意事项一、〖大孔吸附树脂的说明书、规格、标准〗 .... - 3 -二、〖大孔吸附树脂的选择〗.................. - 4 -三、〖大孔吸附树脂的预处理〗................ - 6 -四、〖大孔吸附树脂的吸附条件和解吸附条件的选择〗- 7 -五、〖大孔吸附树脂的吸附〗.................. - 9 -六、〖大孔吸附树脂的工艺验证〗 ............. - 11 -七、〖大孔吸附树脂的再生及使用有效期〗 ..... - 12 -八、〖大孔吸附树脂的残留测定〗 ............. - 13 -一、〖大孔吸附树脂的说明书、规格、标准〗大孔吸附树脂是一类新型非离子型高分子聚合物，具有选择性吸附有机化合物的能力，其吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键等完成的，被广泛应用于药学领域，如抗生素的提取分离、天然产物的分离、中药有效成分的提取分离和复方制剂中杂质的去除等。
大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体 ,加入二乙烯苯为交联剂 ,甲苯、二甲苯为致孔剂 ,它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。
树脂一般为白色的球状颗粒 ,粒度为 20～60 目 ,是一类不含离子交换集团的交联聚合物 ,它的理化性质稳定 ,不溶于酸、碱及有机溶剂 ,不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。
树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质)之间的范德华引力,通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作的 ,使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱而分开达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。
由树脂提供方制订并向应用方提供。
技术要求内容包括：1．规格标准标准内容应包括：名称、牌(型)号、结构(包括交联剂)、外观、极性；粒径范围、含水量、湿密度(真密度、视密度)、干密度(表观密度、骨架密度)、比表面、平均孔径、孔隙率、孔容等物理参数；未聚合单体、交联剂、致孔剂等添加剂残留量限度等参数；用途及相关标准文号等。
天然药物化学-第1章总论-20101026完美修正版全解第一章总论【单选题】1. 高压液相层析分离效果好的主要原因是：BA. 压力高B. 吸附剂的颗粒细C. 流速快D. 有自动记录2.对聚酰胺层析叙述不正确项为：（E ）A.固定相为聚酰胺B.适于分离酚性、羧酸、醌类成分C. 在水中吸附力最大D.醇的洗脱力大于水E.甲酰胺溶液洗脱力最小3.从中草药水煎液中萃取有效成分不能使用的溶剂为（A）A.Me2COB.Et2OC.CHCl3D. n-BuOHE.EtOAc4.下列溶剂亲水性最小的是：（B）A.Me2COB.Et2OC.CHCl3D. n-BuOHE.EtOAc5.回收正丁醇时，应采用：(B)A. 常压蒸馏B.减压蒸馏C.常压蒸发6.比水重的亲脂性有机溶剂是：(C)A.石油醚B.Et2OC.CHCl3D.C6H6E. EtOAc7.某化合物进行硅胶吸附色谱，展开剂为EtOAc：Et2O（9：1），结果R f<0.03,现要增大其R f，宜用（C）A.硅胶板在105℃加热1小时再用原展开剂展开B.改用EtOAc：Et2O（8：2）展开剂展开C.硅胶板在水蒸气中饱和10分钟后再用原展开剂展开8.下列溶剂中极性最强的是：（D）A.Me2COB.Et2OC.CHCl3D. MeOHE.EtOAc9.回收乙醚提取液时，因忘记加入沸石而致暴沸，其补救办法是：(C)A.当即加入沸石B.关闭电源加入沸石C.关闭电源，溶液放冷，加入沸石D.倒出一部分溶液继续加热10.下列哪组混合溶剂不适合结晶法：(D)A. H2O/EtOHB. H2O/Me2COC. EtOH/Et2OD. Et2O /H2OE. EtOH/CHCl311.下列溶剂中溶解化学成分范围最广的溶剂是：(B)A.水B.乙醇C.乙醚D.苯E.氯仿12.吸附剂色谱叙述错误项是：(B)A.固定相常用硅胶或氧化铝B.柱的高度与直径之比为（20~30）:1C.吸附剂粒度为250~300目D.采用干法或湿法装柱E.洗脱应由极性从小到大进行13.世界上最早应用升华法制取有效成分是我国《本草纲目》中记载的：（D）A.香豆素B.苯甲酸C.莽草素D.樟脑E.咖啡碱14.聚酰胺形成氢键的能力与溶剂有关，其强弱顺序是：（A）A.水>有机溶剂>碱性溶剂B.有机溶剂>碱性溶剂>水C.碱性溶剂>有机溶剂>水15.活性炭在下列哪一种条件下吸附性最强：（D）A. 酸性水溶液B.碱性水溶液C.稀乙醇水溶液D.近中性水溶液E.稀丙酮水溶液16.纸色谱属于分配色谱，固定相为：(B)A.纤维素B.滤纸所含的水C.展开剂中极性较大的溶液D.水17.化合物在进行薄层色谱时，常碰到两边斑点R f值大，中间R f 值小，其原因是：（C）A.点样量不一B.层析板铺的不均匀C.边缘效应D.层析缸底部不平整18.葡聚糖凝胶色谱法属于排阻色谱，在化合物分离过程中，先被洗脱下来的为：（C）A.杂质B.小分子化合物C.大分子化合物D.两者同时下来19.氧化铝适于分离哪类成分：（D）A.酸性成分B.苷类C.中性成分D.碱性成分20.有效成分是指：（C）A.需要提取的成分B.含量高的化学成分C.具有某种生物活性或治疗作用的成分D.主要成分21.与水不相混溶的极性有机溶剂是：(D)A.EtOHB.MeOHC. Me2COD.n-BuOH22．硅胶吸附柱色谱常用的洗脱方式是（B）A．洗脱剂无变化B．极性梯度洗脱C．碱性梯度洗脱D．酸性梯度洗脱E．洗脱剂的极性由大到小变化23．乙醇不能提取出的成分类型是（D）A．生物碱B．苷C．苷元D．多糖E．鞣质24．原理为分子筛的色谱是（B）A．离子交换色谱B．凝胶过滤色谱C．聚酰胺色谱D．硅胶色谱E．氧化铝色谱25.利用有机溶剂加热提取重要成分时，一般选用：(C)A.煎煮法B.浸渍法C.回流提取法26．一般情况下，认为是无效成分或杂质的是（B ）A. 生物碱B. 叶绿素C. 鞣质D. 黄酮E. 皂苷27.难溶于水而易溶于氯仿的成分是：（A）A.生物碱B.无机盐C.氨基酸D.胶淀粉E.低级脂肪酸28.影响提取效率最主要因素是：（D）A.药材粉碎度B.温度C.时间D.细胞内外浓度差E.药材干湿度29.除哪种无机盐外，均可用于盐析法：（E）A.氯化钠B.硫酸镁C.硫酸铵D.氯化铵E.硫酸钡30.对凝胶色谱叙述的不正确项：（E）A.凝胶色谱又称作分子筛B.适合分离蛋白质C.常以吸水量大小决定凝胶分离范围D.凝胶吸水量小时，用于分离分子量较小的物质E.大分子被阻滞，流动慢；小分子化合物阻滞小，流动快，故先于大分子被洗脱流出31.下列溶剂能与水混溶的是：（A）A.Me2COB.Et2OC.CHCl3D.C6H6E.EtOAc32.结晶法成败关键步骤：（D）A.控制好温度B.除净杂质C.做成过饱和溶液D.选择合适溶剂E.适当时间33.加热可使硅胶中硅醇基脱水生成硅氧醚结构而丧失吸附力，其最低温度为：（E）A.120℃C.80℃D.200℃E.>200℃34.硅胶薄层板活化最适宜温度和时间：（C）A.100℃/60minB.100~105℃/60minC.100~105℃/30minD.100~115℃/30minE.150℃/30min35.用Sephadex LH-20凝胶柱分离下列化合物时，用含水乙醇洗脱，最后洗脱下来的是：（D）36.淀粉和葡萄糖的分离多采用：（D）A.氧化铝色谱B.离子交换色谱C.聚酰胺色谱D.凝胶色谱E.硅胶吸附色谱37.欲从大分子水溶性成分中除去小分子无机盐最好采用：（C）A.两相溶剂萃取法B.盐析法C.透析法D.结晶法38 中草药用乙醇加热回流提取，醇提取液浓缩后，加水适量，有胶状物析出,此析出物可能是：（C）A. 糖类C. 树脂D. 蛋白质39.采用液-液萃取法分离化合物的原则是：（B）A.两相溶剂互溶B.两相溶剂不互溶C.两相溶剂极性相同D.两相溶剂极性不同E.两相溶剂亲脂性有差异40.从药材中依次提取不同的极性成分，应采取的溶剂极性顺序是：（B）A.水→EtOH→EtOAc→Et2O→石油醚B.石油醚→Et2O→EtOAc→EtOH→水C.石油醚→水→EtOH→Et2O41.对于含挥发性成分的药材进行水提取时，应采取的方法是：（B）A.回流提取法B.先进行水蒸气蒸馏再煎煮C.煎煮法42. 活性炭在下列哪一种条件下吸附性最强? DA. 酸性水溶液B. 碱性水溶液C. 稀乙醇水溶液D. 近中性水溶液E. 稀丙酮水溶液43．利用溶剂较少提取有效成分较完全的方法是：AＡ、连续回流法Ｂ、加热回流法Ｃ、透析法Ｄ、浸渍法44. 离子交换色谱法，适用于下列（B）类化合物的分离Ａ、萜类Ｂ、生物碱Ｃ、淀粉Ｄ、甾体类45．下列（B ）类成分，通常用碱性氧化铝色谱进行分离，而不用硅胶色谱进行分离。
第一章总论——习题一.单选1.樟木中樟脑的提取方法采用的是EA.回流法B.浸渍法C.渗漉法D.连续回流E.升华法2.离子交换色谱法，适用于下列（）类化合物的分离BＡ萜类Ｂ生物碱Ｃ淀粉Ｄ甾体类E糖类3.极性最小的溶剂是CA丙酮B乙醇C乙酸乙酯D水E正丁醇4.采用透析法分离成分时，可以透过半透膜的成分为EA多糖B蛋白质C树脂D叶绿素E无机盐5.利用氢键缔和原理分离物质的方法是 DA硅胶色谱法B氧化铝色谱法C凝胶过滤法D聚酰胺E离子交换树脂6.聚酰胺色谱中洗脱能力强的是 CA丙酮B甲醇C甲酰胺D水ENaOH水溶液7.化合物进行硅胶吸附柱色谱分离时的结果是BA、极性大的先流出B、极性小的先流出C、熔点低的先流出D、熔点高的先流出8.纸上分配色谱,固定相是BA纤维素B滤纸所含的水C展开剂中极性较大的溶剂D醇羟基E有机溶剂9、从药材中依次提取不同极性的成分应采取的溶剂极性顺序是BA、水→EtOH→EtOAc→Et2O→石油醚B、石油醚→Et2O→EtOAc→EtOH→水C、Et2O→石油醚→EtOAc→EtOH→水D、石油醚→水→EtOH→Et2O→EtOAc10、化合物进行正相分配柱色谱时的结果是BA、极性大的先流出B、极性小的先流出C、熔点低的先流出D、熔点高的先流出二、问答题1、硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、离子交换树脂、大孔树脂等层析法的分离原理是什么？各自的分离规律如何？教材P27-40分别论述2、中草药有效成分的提取方法有哪些？其各自的使用范围及其优缺点是什么？教材P17-19分别论述第二章糖和苷——重点内容掌握常见几种单糖的结构（Haworth式）；掌握化学反应的特点及应用；掌握苷键裂解的各种方法及其特点；（如：酸解、碱解、酶解、Smith降解等）1H-NMR及13C-NMR在糖苷中的应用（如：苷键构型的测定、化学位移值大致区间、糖端基碳的化学位移值、利用J值判断苷键构型、苷化位移（含酚苷和酯苷）等。
黄酮类化合物的提取纯化技术程晓雨;胡福良【摘要】黄酮类化合物是蜂胶中的主要功效成分,不仅结构多样,而且还有多种不同的生物学活性,是天然产物研究中的热点之一.本文综述了国内外黄酮类化合物的提取及纯化技术研究进展,重点介绍了一些新兴技术,包括双水相萃取法、半仿生法、高压脉冲电场法,膜分离法、柱层析法等,旨在为蜂胶黄酮的研究应用提供参考.【期刊名称】《蜜蜂杂志》【年(卷),期】2015(035)005【总页数】4页(P1-4)【关键词】黄酮类化合物;提取;纯化;蜂胶黄酮【作者】程晓雨;胡福良【作者单位】浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S896.6黄酮类化合物是泛指两个苯环通过三个碳原子或一个吡喃环或吡喃酮环连接而成的化合物，主要包括：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇、异黄酮类及二氢异黄酮类、查耳酮和二氢查耳酮类及花青素类等[1]。
黄酮化合物广泛存在于绿色植物细胞中，是一种次生代谢产物，不仅结构多样，而且不同结构的化合物表现出不同的生物学活性，主要有：抗菌、抗病毒[2]、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗癌、抗肿瘤、护肝、对心血管疾病的作用、对过敏和哮喘的作用[3]等药理活性，在医药、食品和日化等行业得到广泛的开发利用。
黄酮类化合物的传统提取方法存在能耗大、提取率和效率低、溶剂残留及不利于母核的保护等局限性。
随着现代科学技术与仪器的发展，一些新兴的提取方法应运而生，日益普及。
黄酮类化合物是蜂胶的主要功效成分，但对蜂胶黄酮的提取纯化技术的研究相对较少。
运用适宜的技术提取纯化纯度高、活性强的蜂胶黄酮具有重要意义。
本文综述了国内外对各种天然产物中黄酮类化合物的提取纯化技术，旨在为蜂胶黄酮类化合物的研究、开发和应用提供参考。
黄酮类化合物的提取是根据相似相溶的原理，根据黄酮类化合物的极性、溶解性差异选择合适溶剂，并辅助一定破壁措施进行初级分离。
1.通常具有提高机体免疫活性作用的成分是（）。
∙ A 萜类∙ B 强心苷∙ C 皂苷类∙ D 多糖正确答案:D单选题2.用50%以上浓度的乙醇作为溶剂，不能提取出的中药化学成分类型是（）。
∙ A 苷类∙ B 树脂∙ C 多糖类∙ D 甾体类∙ E 挥发油正确答案:C单选题3.用Sephadex LH-20柱色谱分离下列化合物，以甲醇洗脱，最后洗脱的化合物是（）。
∙ A 槲皮素-3-芸香糖苷∙ B 山奈酚-3-半乳糖鼠李糖-7-鼠李糖苷∙ C 槲皮素-3-鼠李糖苷∙ D 槲皮素∙ E 木犀草素正确答案:D单选题4.水溶性最大的黄酮类化合物是（）。
∙ A 黄酮∙ B 花色素∙ C 二氢黄酮∙ D 查尔酮∙ E 异黄酮正确答案:B单选题5.以Sephadex LH-20柱色谱分离下列黄酮类化合物，最先流出色谱柱的是（）。
∙ A 芹菜素∙ B 杨梅素∙ C 槲皮素∙ D 甘草素∙ E 山柰酚正确答案:D单选题6.大多数木脂素是由（）个C6-C3单元组成的（）。
∙ A 1∙ B 2∙ C 3∙ D 4∙ E 5正确答案:B单选题7.可作为天然药物中挥发性有效成分提取的方法是（）。
∙ A 铅盐沉淀法∙ B 结晶法∙ C 两相溶剂萃取法∙ D 水蒸气蒸馏法∙ E 盐析法正确答案:D单选题8.提取原生苷不能用的溶剂或方法有（）。
∙ A 冷水浸泡∙ B 沸水提取∙ C 甲醇提取∙ D 60％乙醇提取∙ E 95％乙醇提取正确答案:A单选题9.黄酮类化合物能呈色的主要原因是（）。
∙ A 具有交叉共轭体系∙ B 具有助色团∙ C 为离子型∙ D 具有芳香环∙ E 具有酮基正确答案:A单选题10.花青素溶于水是因为（）。
∙ A 羟基多∙ B 离子型∙ C 有羧基∙ D C环为平面型分子∙ E C环为非平面型分子正确答案:B单选题11.高浓度乙醇（60％以上）可以沉淀的成分类型是（）。
∙ A 游离生物碱∙ B 苷类∙ C 大分子有机酸∙ D 多糖∙ E 甾体类化合物正确答案:D单选题12.聚酰胺薄层色谱时，展开能力最强的展开剂是（）。
大孔吸附树脂技术摘要：本文综述了大孔吸附树脂性能、分离原理、类型以及在天然产物提取分离中的应用，总结了大孔吸附树脂的操作方法，注意事项，试图为大孔吸附树脂的选择使用提供依据。
关键词：大孔吸附树脂，操作方法，选型，安全性一. 前言中药现代化是我国传统中药发展的必然趋势。
作为中药现代化的基础性研究，中草药有效成分的提取和分离是目前研究的热点和重点[1,2]。
吸附脱附法是中草药有效成分提取分离的常用方法。
聚酰胺、硅胶、氧化铝是常用的吸附剂，但使用聚酰胺、硅胶、氧化铝等作为吸附剂，存在分离效果差、提取工艺复杂、吸附剂预处理工序复杂以及吸附剂回收率低等缺点，不适合中药现代化的要求。
大孔树脂（包括大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂）与普通凝胶树脂的合成方法不同，因其内部具有三维空间立体孔结构，孔径与比表面积都比较大而得名。
大孔离子交换树脂与大孔吸附树脂的界线有时很难划分。
一般观点认为[3]，依靠物理界面力作用引起溶液中溶质浓度的减少称为吸附，因化学作用引起溶液中溶质变化的称为离子交换。
起离子交换与吸附作用的树脂分别称为离子交换树脂和吸附树脂。
大孔吸附树脂（macroporous absorbing resin）是20世纪60年代发展起来的高分子聚合物树脂，具有大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，已在废水处理、医药工业、食品工业等得到广泛应用。
二. 大孔吸附树脂的性能和分离原理大孔吸附树脂一般为白色球状颗粒，粒度为20～60目，不溶于水、酸、碱及有机溶剂。
在水和有机溶剂中可吸收溶剂而膨胀，在室温下对稀酸稀碱稳定。
从显微形状上看，大孔树脂包含有许多具有微观小球组成的网状孔穴结构，这些球体的构成多为苯乙烯型和2-甲基丙烯酸脂型，前者为非极性树脂，后者为中极性树脂。
大孔树脂的“孔径”是指微观小球之间的平均距离（Å），其“表面积”是指微观小球表面积的总和（m2/g）。
大孔吸附树脂颗粒的总表面积很大，加上合成时引入了一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另一方面，这些网状孔穴在合成树脂时具有一定的孔径，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。
第３４卷，第９期 光谱学与光谱分析Vol 畅３４，No 畅９，pp ２５６８‐２５７２２０１４年９月 Spectroscopy and Spectral Analysis September ，２０１４ HPLC 结合紫外光谱法快速定性定量分析四种竹叶黄酮碳苷张春娟１，孟志芬２，郭雪峰１倡，岳永德１，汤 锋１，喻 谨１，陈 超１，３１畅国际竹藤中心，北京 １００１０２ ２畅河南科技学院化学化工学院，河南新乡 ４５３００３３畅安徽农业大学资源与环境学院，安徽合肥 ２３００３６摘 要 采用HPLC 结合紫外光谱法，同时测定四种竹叶黄酮碳苷（荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷）。
采用Waters XTerra MS C １８色谱柱（２５０mm ×４畅６mm ，５μm ），流动相为乙腈和０畅５％甲酸水溶液，等梯度洗脱，流速１mL ·min －１，柱温３０℃，检测波长３６０nm 。
建立各个组分在０畅１～１０畅０mg ·L －１范围内系列浓度的混合标准工作曲线，其相关系数R ２均优于０畅９９９，且在２２min 内得到较好分离。
方法检出限介于０畅０３～０畅０７mg ·L －１，定量限介于０畅０４～０畅０８mg ·L －１。
分别将标准品与样品中四种黄酮碳苷的紫外光谱（２４０～４００nm ）进行比对，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷相应的光谱曲线形状以及特征吸收波长都表现出高吻合度。
取竹叶样品经热回流提取，石油醚萃取及AB ‐８大孔树脂纯化后，再采用HPLC 结合紫外光谱法检测得荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷四种黄酮碳苷相对于竹叶黄酮粉的百分含量分别为１３畅７３，４９畅６８，７畅８５和３０畅７０mg ·g －１，平均回收率为３４畅９０％～８７畅６４％，相对标准偏差为０畅４１％～１０畅８３％。
本方法实现了在较短时间内快速分析竹叶中四种黄酮碳苷，样品稳定，重现性好，为市售竹叶黄酮碳苷的质量控制提供参考。
第1章总论一、选择题1 A 2B 3B 4A 5A 6B 7BB二、判断题1 √2 √ 3√ 4 х三、区分C→ A→ D→ B四、问答1、乙醇 > 丙酮 > 乙酸乙酯 > 乙醚 > 氯仿 > 环己烷2、正戊醇>正丁醇>乙酸>吡啶>甲苯>苯>乙酸乙酯>甲醇>氯仿>丙酮>二氯甲烷>乙醚3、A < B < C < D4、硅胶，氧化铝，聚酰胺，活性炭，大孔树脂硅胶显微酸性，表面硅醇基与化合物形成氢键而具有一定的吸附能力，能用于非极性和极性化合物的分离，不宜分离碱性物质；氧化铝分为碱性、中性和酸性，碱性和中性氧化铝不适用于分离酸性成分；聚酰胺通过形成氢键来吸附化合物；活性炭对芳香化合物、大分子化合物以及极性基团多的化合物吸附力强；大孔树脂是吸附性和分子筛原理相结合的分离材料，它的吸附性是由范德华力或产生氢键的结果五、名词二次代谢产物：在特殊的条件下，一级代谢产物作为原料又进一步经历不同代谢过程生成的物质，这些物质对维持植物生命活动来说不起重要作用。
HPLC:高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
DCCC: 属液-液分配色谱，流动相和固定相互相分层的两相溶液，流动相以液滴形式垂直上升或下降通过固定相的液柱，实现逆流色谱分离。
FAB-MS:从离子枪射出的一次离子，经加速后在碰撞室碰撞后，交换电荷，产生高速中性粒子，该高速中性粒子进一步撞击试样即可使之电离，得到分子粒子及其进一步裂解碎片。
HR-MS:高分辨率质谱是能够直接给出具体分子量，并且精确到小数点后四位，高分辨质谱不仅能确定分子式，而且还能确定碎片的组成式六、填空水提液强酸型树脂通过液被吸附物质强碱性树脂 1 . NH4OH2. 强碱性树脂通过液被吸附物质( 中性 ) 稀碱液通过液被吸附物( 碱性 ) 用HCl洗(酸性) ( 两性 )第二章糖和苷类一、选择1C 2B 3B 4A 5A 6C二、填空1、72、专属3、糖、苷元、槲皮素、葡萄糖、鼠李糖4、浓硫酸和α-萘酚，糖，在液层交界处呈现紫色环三、简述1、苷：糖或糖的衍生物与非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的化合物；其连接的键称为苷键；在植物体内原生的苷是原生苷；从原生苷中脱掉一个以上单糖的苷称为次生苷；低聚糖：由2-9个单糖通过苷键结合而成的直链或支链聚糖多聚糖：由10个以上单糖通过苷键连接而成的糖苷化位移：糖与苷元成苷后苷元的α-C、β-C和糖的端基碳的化学位移值均发生了改变，这种改变称为苷化位移2、糖或糖的衍生物与非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的化合物称为苷类化合物。
抗菌肽的提取分离及抑菌机理研究进展一、本文概述抗菌肽，又称抗菌蛋白质或抗菌因子，是一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。
自20世纪80年代以来，抗菌肽因其独特的抗菌机制和广泛的应用前景，受到了全球科研人员的广泛关注。
本文旨在综述抗菌肽的提取分离技术以及其抑菌机理的最新研究进展。
文章首先对抗菌肽的定义、分类及其抗菌特性进行概述，接着详细介绍抗菌肽的提取分离方法，包括传统提取方法、现代生物技术提取方法以及新兴的纳米技术提取方法等。
随后，文章对抗菌肽的抑菌机理进行深入探讨，包括其直接杀菌作用、免疫调节功能以及与其他抗菌剂的协同作用等。
文章对抗菌肽的研究前景和应用领域进行展望，以期为抗菌肽的研究和开发提供有益的参考和启示。
二、抗菌肽的提取方法抗菌肽的提取和分离是抗菌肽研究的重要环节，其方法的选择和优化直接影响到最终产物的纯度和活性。
抗菌肽的提取方法主要包括物理法、化学法、生物酶解法以及近年来兴起的基因工程技术等。
物理法主要利用温度、压力、溶剂等因素对抗菌肽进行提取。
例如，通过控制温度和压力，利用超临界流体萃取技术可以从生物组织中提取抗菌肽。
这种方法具有提取效率高、对原料破坏小等优点，但设备成本较高，操作复杂。
化学法主要利用化学试剂对抗菌肽进行提取。
常用的化学试剂包括酸、碱、有机溶剂等。
酸碱提取法通过改变溶液的酸碱度，使抗菌肽从组织中溶解出来。
有机溶剂提取法则利用有机溶剂对目标物质的溶解能力，将抗菌肽从原料中提取出来。
化学法提取效率高，但可能引入杂质，影响产物的纯度。
生物酶解法利用特定的酶对原料进行水解，从而释放出抗菌肽。
这种方法具有条件温和、产物纯度高等优点，但酶的选择和酶解条件的优化是关键。
常用的酶包括蛋白酶、纤维素酶等。
近年来，随着基因工程技术的发展，越来越多的研究者开始利用基因工程手段提取抗菌肽。
通过基因克隆和表达，可以在体外大量合成抗菌肽，从而实现对抗菌肽的高效提取。
这种方法具有产物纯度高、产量大等优点，但技术难度较大，需要较高的研究水平。
通过大孔树脂柱层析和制备HPLC分离和纯化竹叶中具有抗氧化活性的4种C-糖苷黄酮摘要：目前已研究了4种C-糖苷黄酮，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的制备方法,而这些C-糖苷黄酮都是从乙醇提取物水溶液（即竹叶抗氧化物AOB）里通过AB-8大孔树脂和制备HPLC（流动相：10%和15%(V/V)乙腈/1%醋酸）制得的。
近而用甲醇和水分别作反溶剂和盐析剂，通过反溶剂结晶法来纯化得到这些C-糖苷黄酮。
纯度是由分析HPLC谱图来估算的，而化学结构的确定是由IR，MS,NMR和UV谱图来确定的。
由5LAOB浓缩液得到的6.5g粗品，柱层析后制得了荭草苷（49mg）、异荭草苷（142mg）、牡荆苷(15mg)、异牡荆苷(62mg)。
这些方法比较适用于制备足量的纯C-糖苷黄酮，以确定竹叶中的荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的量。
关键词：C-糖苷黄酮；大孔树脂；制备HPLC；反溶剂结晶；竹叶抗氧化物1.简介在生物学上，二级植物代谢物是活性物质，具有保护人体健康的非营养物。
黄酮——植物多酚二级代谢物的一大类——广泛分布于药草、果实、茶叶等中。
黄酮，存在于人类的食物中，对人体健康产生了特殊的作用，包括抗氧化活性，心脏血管疾病的防治，癌症的预防等。
C-糖苷黄酮是黄酮家族的一个重要的一类，在一些植物中被发现，例如，紫檀树和葫芦科果实中。
C-糖苷黄酮的多种生物活性已被报道过，包括异荭草苷（毛地黄黄酮-6-糖苷）和牡荆苷（芹菜素-8-糖苷）的抵抗金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，绿脓杆菌的抗菌活性，也包括毛地黄黄酮-7-糖苷对于抵抗由CCl4引起的肝伤。
竹叶抗氧化物（AOB）是一种从竹叶中提取出来的灰褐色粉末，能够阻碍脂肪的自动氧化的链反应，螯合过渡态的金属离子，清除亚硝酸化合物和阻碍亚硝胺的合成。
另外，AOB是一种很强的抗氧化剂，能够抑制过渡金属离子和自由基诱导的体外高分子的恶变。
在中国，AOB已被证明是一种新的食物抗氧化剂，它能够被加进疏松的食品，水产品，肉类，可食用油，谷类，面包，水果及蔬菜汁，茶饮料和油炸食品中，这些都已经过中国卫生部门认证。
AOB的主要功能成分包括黄酮、内酯和酚酸，而C-糖苷黄酮是在AOB中的一种具有代表性的成分。
AOB中的四种C-糖苷黄酮的化学结构，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷，如Fig.1所示。
先前我们研究组进行了代谢研究，报道了这四种C-糖苷黄酮在胃肠管道中很少被吸收，这种C-糖苷黄酮在体内很少吸收的特征表明它们可能在药理活性上有潜力。
虽然黄酮的多种药理学效应已被报道在许多同行评审期刊中，但是很少有研究员把注意力集中在动物或人体中的C-糖苷黄酮的官能团特性上。
这些方面研究状况部分归因于C-糖苷黄酮单体的获得。
为了处理这个问题，研究员发现并使各种药草中的黄酮的制备技术更优化。
高速逆流色谱（HSCCC）和制备型柱层析被广泛使用。
制备HPLC和相关的技术是植物药草中活性成分的分离和纯化的一种有效的方法。
然而，和HSCCC及柱层析相比，很少有研究员能用制备HPLC方法分离和纯化植物中C-糖苷黄酮，并使其优化。
这个研究的目标是建立一种使用树脂柱层析和制备HPLC技术AOB中的四种C-糖苷黄酮（荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷）的分离和纯化的新方法。
2. 实验2.1化学药品荭草苷（5，7，3′-4′-四羟基黄酮-8-糖苷）、异荭草苷（5，7，3′-4′-四羟基黄酮-6-糖苷）、牡荆苷（5，7，4′-三羟基黄酮-8-糖苷）、异牡荆苷5，7，4′-三羟基黄酮-6-糖苷）（HPLC级）从Extraynthese购买。
乙腈和乙酸乙酯（都是HPLC级）从Tedia购买。
甲醇（HPLC）级由Merck购买。
研究中使用的其它所有溶剂和化学物质均为分析纯。
蒸馏水在大孔树脂柱层析中使用，而通过Milli-Q系统净化的纯净水在HPLC中使用。
将这4种C-糖苷黄酮溶解于50％（V/V）甲醇水溶液制得储存液和工作标准液。
工作标准液能在4℃下稳定保存3个月。
2.2样品AOB的浓缩液是由浙江大学Innoessen有限公司提供的。
AOB由紫竹变种的竹叶制得的。
简要的说，秋季在安吉采集新鲜的竹叶，然后干燥。
在粉碎和过筛（20-40目）之后得到竹叶的粗粉，然后取10g 粉末使用加热回流的方法用100ml30％(V/V)乙醇水溶液提取1小时，然后滤出液用滤膜分离，用来去除大分子和小分子物质（例如多糖和矿物质），最后真空浓缩之后得到AOB浓缩液，加到已处理好的大孔树脂柱层析中。
2.3AB-8大孔树脂柱层析用一个装满AB-8大孔吸附树脂（聚苯乙烯树脂、颗粒大小：0.3-1.25mm）的低压的玻璃层析柱（150cm×100mmLD）来作树脂柱层析。
使用前树脂柱要经过预处理。
详细的说，层析柱先用24L 5％（V/V）盐酸活化，然后平衡，即用蒸馏水以60mL/min的流速洗至中性。
同样地，再用24L 5％（V/V）NaOH活化,再用蒸馏水以同样的流速洗至中性，使柱子达到平衡。
然后将5LAOB浓缩液装入已经预处理的柱中，静态吸附过夜。
用25L蒸馏水洗。
再用25L 50％（V/V）乙醇溶液以60mL/min的流速将C-糖苷黄酮洗脱下来，并小心将这部分流分收集起来。
用旋转蒸发仪浓缩蒸干，并用600ml 50％（V/V）甲醇溶液溶解。
最后，浓缩液用于HPLC分析。
2.4 制备HPLC分离Waters DeltaPrep 400 Preparative ChromatographyWaters Prep LC ControllerWaters 2487 Dual λAbsorbance Detector (Waters, Milford, MA, USA)Bondapak® C18 preparative column (300 mm × 7.8 mm，I.D：10 um; Waters, Milford, MA, USA)流动相：乙腈（溶剂A）和1％（V/V）醋酸（溶剂B），使用用于分离的梯度洗脱顺序如下：10％A（180min），10-15％A(0.1min)，15％A（60min）。
流速为25mL/min，而检测波长为330nm。
进样量为10ml。
2.5分析HPLC为了分析柱层析组分、制备HPLC组分和进一步纯化的样品中的C-糖苷黄酮，分析HPLC条件如下：采用了Waters2695HPLC色谱仪和Luna C18 (250 mm ×4.6 mm，I.D：5 um)，其中保护柱为：RP18 (4.0 mm ×3.0 mm，I.D：5 um)，这两根柱都从Phenomener购买。
采用梯度洗脱，流动相：溶剂A（乙腈）和溶剂B（1％(V/V）醋酸，用NaOH调pH至3.0)。
梯度顺序：15％A（15min），15-40％A(10min)，40％A（9min），40-15％A（6min）。
流速为1.0mL/min，进样量为3.0ul。
柱温40℃。
在330nm用DAD进行信号检测。
2.6C-糖苷黄酮的进一步纯化从制备HPLC分离得到的4种C-糖苷黄酮的组分分别用旋转蒸发仪进行浓缩蒸干。
每一种残渣用10ml甲醇再溶解，并转移到离心管中。
在离心管中加入等体积（10ml）的纯净水，然后在4℃下放置过夜。
所分析的物质通过反溶剂结晶法大量沉淀下来，然后在4℃下离心（10000r/min,20min）。
小心地去除上清，洗涤干燥后得到终产品。
2.7C-糖苷黄酮的鉴定C-糖苷黄酮的单体通过IR，UV，MS，1H-NMR和13C-NMR光谱来鉴定。
IR：Nexus 670 Flourier Transform Infrared Spectrometer (Thermo Nicolet, San Jose, CA, USA)UV：HPLC-DAD analysis (Waters, Milford, MA, USA)MS：an APEX III Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA)1H-NMR和13C-NMR：DMX-500 (500 MHz) NMR spectrometer(Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Germany)3. 结果和讨论3.1 树脂柱层析先前的研究讨论了使用HSCCC或硅胶柱层析法从植物药草中分离出C-糖苷黄酮。
Zhou, Peng, Fan, & Wu (2005)使用HSCCC技术同时分离纯化荭草苷和牡荆苷。
Afifi, Khalil, & Abdalla (1999)使用硅胶柱层析从海芋属植物palaestinum中分离出异荭草苷，且进一步使用重结晶纯化它。
目前，AB-8树脂柱层析主要被用于从AOB中分离出总C-糖苷黄酮，而不是分离某个C-糖苷黄酮单体。
聚苯乙烯（AB-8）树脂，是一种交联聚合物，在它的骨架结构中有着大量的亲水基团，对于分离许多生物学物质，例如苯酚和糖类，具有强大的能力，且回收率较高。
这归功于它的巨大特效表面区域和适当的微孔体积。
由于在AOB中的主要功能成分包括黄酮、内酯和酚酸，所以在柱层析中，杂质的清除和C-糖苷黄酮的提取是必需的。
AOB稀溶液的HPLC分离（根据2.5部分）显示在图2.a中。
从DAD光谱每一个峰的UV吸收所显示的结果表明，大多数酚酸在9分钟前被洗脱出来。
跟酚酸相比，4种C-糖苷黄酮的极性较小，以致于这些化合物被洗脱需要更长的保留时间（范围大约为：9-17min）。
在这种情况下，吸附在AB-8树脂上的AOB先用蒸馏水洗去酚酸、矿物质和糖类，然后用50%（V/V）乙醇洗脱得到C-糖苷黄酮部分。
蒸馏水洗脱部分和50%（V/V）乙醇洗脱部分的HPLC谱图分别如图2b和2c所示。
HPLC分析结果显示大多数酚酸经过水洗从AB-8树脂上洗脱下来，而在50%（V/V）乙醇部分就很少了。
但是一些其它的化合物（通过DAD光谱对每一个峰的UV吸收来确认是香豆素类化合物和弱极性的黄酮类化合物）也在50%（V/V）乙醇部分中被发现（保留时间范围：20-40min）。
这些杂质可通过制备HPLC进一步去除。
经旋转蒸发仪浓缩蒸干之后，经AB-8树脂柱层析后得到了6.5g总C-糖苷黄酮。
3.2制备HPLC分离Kumarasamy等（2004）使用制备HPLC成功地优化了4种C-糖苷黄酮（包括异荭草苷、当药羟基黄素、当药黄素、isoscopatin-2”-β-D-葡萄糖苷）的分离制备。
虽然先前的研究报道了关于C-糖苷黄酮的层析分离方法（包括HSCCC和制备HPLC），但是很少有研究者把注意力集中在关于C-糖苷黄酮的多种异构体的层析分离方法上。
