二苯胺试剂鉴定DNA

DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告实验目的：本实验旨在掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。

实验原理：在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。

其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω-羟基-y-酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。

当样品DNA的含量在40-400µg范围时，光密度与DNA的浓度成正比。

样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质、脱氧核糖、阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。

在反应中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

试剂与仪器：DNA标准液、二苯胺试剂、样品溶液、试管与试管架、吸管与洗耳球、可见分光光度计。

DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定：取8支洁净干燥的试管，按表格操作。

混合后，于60度水浴中保温1小时，冷却至室温中，用分光光度计测定吸光值A595nm。

以DNA浓度为横坐标吸光值A595nm为纵坐标，绘制标准曲线，对照组标准曲线计算样品中DNA的含量。

实验结果与讨论：通过实验得出DNA标准曲线，y=0.0098x，求出X1=40.71µg/ml，X2=39.39µg/ml，平均DNA 浓度为40.05µg/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%。

注意：文章中的一些数字和符号可能需要根据实际情况进行调整。

分析：本实验使用标准曲线求得的DNA浓度为40.05µg/ml。

在40-400µg范围内，光密度与DNA浓度成正比，因此使用标准曲线求得的浓度是准确的。

此外，DNA的标准曲线线性关系的R2为0.9966，证明DNA光密度的关系密切，因此求出的浓度也比较精确。

然而，本实验测得的DNA含量比整体水平偏低。

造成这种偏低的原因可能是以下几个方面：1.在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，从而导致实验存在误差。

DNA定量测定(二苯胺法)实验报告
实验目的：利用二苯胺法对DNA进行定量测定，获得DNA
的浓度信息。

实验原理：二苯胺法是一种常用的DNA定量测定方法。

其原
理是DNA与二苯胺反应生成发色产物，并在560 nm波长下
具有最大吸收量，通过测定吸光度来计算DNA的浓度。

在实
验中，先将待测的DNA样品与二苯胺溶液反应得到发色产物，然后通过比较其吸光度与已知浓度标准曲线的关系来计算待测样品的DNA浓度。

实验步骤：
1. 准备工作：将工作区域消毒，摆放实验所需仪器器材。

2. 制备标准曲线：依次稀释5 μg/mL的DNA溶液，得到一系
列不同浓度的DNA标准溶液。

将标准溶液与相同体积的二苯
胺溶液混合，反应10分钟。

然后在560 nm波长下测定溶液的吸光度，并绘制标准曲线。

3. 处理待测样品：将待测样品与相同体积的二苯胺溶液混合，反应10分钟。

然后在560 nm波长下测定溶液的吸光度。

4. 计算DNA浓度：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代
入计算公式，得到DNA的浓度。

实验结果：
标准曲线数据：（以吸光度为横坐标，DNA浓度为纵坐标）
吸光度（A） DNA浓度（μg/mL）
0.1 1
0.2 2
0.3 3
0.4 4
0.5 5
待测样品数据：
吸光度（A） = 0.25
根据标准曲线计算得到的DNA浓度为2.5 μg/mL
实验结论：根据二苯胺法对DNA的定量测定结果，待测样品的DNA浓度为2.5 μg/mL。

⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定　本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。

⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。

鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

⼆苯胺试剂的配制A液：　15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。

如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。

B液：　⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。

配制：　将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。

DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。

塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。

研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。

2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料　将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。

②取材　称取30 g菜花,去梗取花,切碎。

③研磨　将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。

④过滤　在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。

在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。

⑤加冷酒精　将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。

沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。

⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。

(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂　取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。

②鉴定　取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。

⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。

二苯胺试剂鉴定DNA的原理二苯胺试剂鉴定DNA的原理一、定义二苯胺试剂（Diels-Alder Reagent）是一种有机化学试剂，用于识别DNA特定序列的定向性反应，也称为定向碱基异构酶（DBA）试剂。

该反应原理的应用有助于鉴定DNAsites的结构以及多段和复合份额的识别。

二、原理二苯胺试剂的反应受特定的DNA序列控制。

当两个特定的DNA序列（A和B）结合在一起时，二苯胺试剂不会发生反应。

当两个相邻的DNA同源片段（测序DNA被称为probe DNA）与目标DNA结合时，二苯胺试剂将发生化学反应，从而形成定向碱基异构化反应（DBAR）。

当两个DNA同源片段（A和B）以相反的方向连接在一起并且probe DNA与target连接在一起时，将发生相反的DBAR反应，从而允许研究人员确定多段复合份额结构和激活片段的位置。

三、步骤1. 准备试剂：用于鉴定DNA序列的二苯胺试剂主要包括：四氢三唑，苯胺试剂，deoxyuridine triphosphate（dUTP），十六烷基三甲基溴化氢，二硫代乙酸盐，硫酸铵，三氟异丙醇，氯化钠和氯仿。

2. 生物实验：首先，把一定量的DNA与二苯胺试剂，孵育物质以及制剂混合物一起混合搅拌，使其充分接触。

所得的混合物应放在微孔板的特定位置，经过30分钟的反应，可完成DNA的定向碱基异构化反应。

3. 检测结果：在用正片胶将实验测试物涂覆之后，用UV波长或紫外可见对应射线下照射，发现接受了二苯胺化学反应和定向碱基异构化反应的物质和连接物会吸收紫外线，通过经典的水滴检测法即可看到反应得到的结果。

四、应用二苯胺试剂技术可以用于鉴定DNA特定序列的结构，可以识别多复制份额DNA结构，可以用于对染色体进行谱系定向标记，可以用于精确的基因组生物学和染色体学研究。

实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。

二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。

除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。

HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具 （一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。

2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。

3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。

临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。

（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。

）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。

根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。

DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。

二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。

如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。

B液:乙醛的体积分数为%的溶液。

配制:将mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。

DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。

当NaCl的物质的量浓度为mol／L时,DNA的溶解度最低。

利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。

不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。

利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。

2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。

实验用具鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。

实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

5 min2．溶解DNA：3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。

3 min6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。

5 min8．DNA的鉴定：沸水浴5min【实验十二】DNA的粗提取与鉴定实验原理DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。