下载文档原格式
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。
这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。
下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。
这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。
细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。
蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。
这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。
在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。
标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。
这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。
杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。
反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。
常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。
通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。
例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。
它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。
本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。
原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。
通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。
下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。
可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。
样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。
2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。
可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。
为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。
3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。
这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。
4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。
5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。
这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。
6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。
可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。
接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。
探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。
此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。
2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。
可以通过调整这些条件来提高杂交效果。
此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。
原位杂交实验具体步骤及详细方法原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P 等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目的是：(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张 莹,王 波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。
结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。
拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。
拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。
拟南芥培养Protocol拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃,夜温最好比日温低2℃,适宜的湿度为60-70%,生长期适宜的光强为150μmol·s-1·m-2(6支36W日光灯下35cm处测得)。
幼苗期不耐高光强,可适当遮荫.光质也较重要,应选用植物生长专用的日光灯(如荷兰产TLD型Philip豪华直管荧光灯).拟南芥在日照长于12小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳1.准备发苗培养基:1/2 MS,Sucrose:10g/L,pH5.7,agar:0.7-0.8%.灭菌后,在超净台上分装入培养皿.2.种子消毒:种子放在1.5ml试管中, 加入1ml10%NaClo,混匀,消毒5min,用无菌水洗5次以上(用移液枪吸).3.播种:用移液枪将种子吸到培养皿上,可多加些水,将种子铺均匀(不要太密,太密根缠在一起不好移苗),用移液枪吸干水,在超净台上让培养皿干了,密封盖子,4℃暗处理两天后,移到光照培养箱(22℃,光周期12h),若种子较密,则在光照培养箱中生长1周后即可移苗,否则根长太长后易缠在一起,但太小的苗移栽后,需适当遮荫.最好是在每皿<30株这样的密度下,让其生长两周后再移苗.4.移苗:将蛭石与珍珠岩按(3:1)的比例混好,装入花盆,将花盆放入有水的塑料周转框中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来,待花盆中的基质湿透后即可移苗.小心轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗,把根平放在蛭石表面,用镊子把根轻轻压下.移苗结束后,用保鲜膜覆盖3-4天后揭膜.从苗期直至开花,可在塑料周转框中始终保持1-3cm的水层,在开始收籽期,不再需要过多的水分,可保持塑料周转框干燥,此时每隔2-3天浇一次水即可.整个生长期可浇3-4次拟南芥营养液.5.收籽:在种荚变黄,变干时可以收籽.将种子抖落在纸上,用金属滤网过一下以除去杂质,将种子装入写了标记的小纸袋中,放于干燥的环境中让种子进一步干燥后,封存于1.5ml试管中.附拟南芥营养液配方nutrient solution containing:5mM KNO3, 2.5mM KH2PO4, 2mM MgSO4, 2mM Ca(NO3)2, 50µM Fe-EDTA, 70µM H3BO4,14µM MnCl2, 0.5µM CuSO4, 1µM ZnSO4, 0.2µM Na2MoO4, 10µM NaCl, 0.01µM CoCl2, adjusted to PH 5.7具体配法（药品刚好50L水培液用）:1)大量元素（包括25.25gKNO3，24.65gMgSO4·7H2O ,）：溶解，加水至500ml,配制成100倍母液Ⅰ。
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交实验步骤原位杂交实验呀，就像是一场精心编排的舞蹈。
首先呢，得准备好舞台，也就是标本的处理。
这就好比给舞者们准备一个合适的场地，要把标本固定好，让它稳稳地待在那儿，可不能在中途出啥岔子。
接下来，就是探针的准备啦。
这探针就像是舞蹈的主角，得精心挑选和设计。
它要能准确地找到自己的目标，和标本上特定的序列结合。
然后，杂交这一步可太关键啦！就像舞者们在舞台上的精彩互动。
让探针和标本在合适的条件下相遇、结合，产生奇妙的反应。
之后呢，要进行信号的检测。
这就好比要看到舞者们的精彩表现呈现出来的效果。
通过各种方法，让杂交后的信号能够清晰地被我们看到。
再说说洗片这一步吧，就像是给舞台打扫干净。
把多余的杂质、干扰都去掉，只留下最精彩的部分。
整个过程中，每一步都得小心翼翼，就跟跳舞时每个动作都要精准到位一样。
要是哪一步出了差错，那可就像舞蹈中出现了失误，会影响整个演出的效果呀！做原位杂交实验，还得有耐心。
不能着急忙慌的，得一步一步慢慢来。
就像跳舞，不能一下子就跳到结尾，得按照节奏，一个动作一个动作地来。
而且呀，实验环境也很重要呢。
温度啦、湿度啦，都得控制好，这就好比舞蹈的灯光、音响，得配合得恰到好处，才能让整个表演更加完美。
想象一下，如果标本处理得不好，那后面的步骤不就都白费啦？或者探针没准备好，那还怎么去找到目标呢？所以啊，每一步都不能马虎，都得认真对待。
这原位杂交实验，可不就是一场科学与技术的精彩舞蹈嘛！咱可得把这场舞跳好，跳出精彩，跳出成果来！这就是原位杂交实验的步骤啦，大家可都得记住咯！。
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。
所使用的熔蜡管（管盖高压湿热灭菌）、烧杯、量筒和药勺均需180℃烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。
切割后应立即固定。
取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。
300 ml量为例）1、用三角瓶配制300 ml PBS缓冲液，加入1粒NaOH，摇动溶化。
2、把上述溶液在微波炉中加热（通常用600 W，1分钟，一般不超过600C）。
3、在通风橱中往三角瓶中加入4%多聚甲醛(12 g)、0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1%Triton(300 ul)，然后用parafilm封口，摇匀直到完全溶解（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。
4、置于冰上降至室温，用硫酸调pH 至7.0（参见第三部分之“一”）。
5、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用20 ml的小瓶，倒满至18 ml左右）。
6、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用，或-200C保存备用（只能冻融一次）。
二、固定材料1、取植物新鲜材料，切至适当大小。
注意：所固定的材料越小越好，尽可能切除无用多余的部分。
2、把切块投入装有甲醛溶液的小瓶中（此时小瓶应在冰浴中）。
注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（一般切块为15 × 5 × 3 mm时，每瓶中的切块数不多于5个；固定液:材料≥20:1）。
3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。
原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。
它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。
本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。
一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。
探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。
二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。
固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。
常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。
三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。
脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。
脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。
四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。
在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。
一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。
五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。
洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。
洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。
六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。
通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。
此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。
原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来.1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
多种探针标记检测系统基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法.荧光标记检测常为直接探针标记方法,如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。
由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。
但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。
常用的报告分子如地高辛，生物素。
结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。
地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。
这是相较于生物素标记系统的优势。
地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果.但需注意,由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活,以降低检测背景.通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测.原位杂交中探针的选择DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。
寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。
DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度,通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
原位杂交实验操作步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。
2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3.轻轻摇匀，冰浴30min。
4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。
3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。
6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。
恒压50V，进行电泳。
7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
一、实验目的本实验旨在通过植物原位杂交技术，对藜属植物染色体组进行核型分析，以揭示藜属植物染色体组的基本特征，为藜属植物的遗传育种和分类学研究提供理论依据。
二、实验材料与试剂1. 实验材料：- 5种藜属植物（灰绿藜、藜、菊叶香藜、杂配藜及藜麦）- 5S rDNA和45S rDNA探针2. 实验试剂：- 甲醛- 乙醇- 盐酸- 染色剂（如醋酸洋红）- 封片剂三、实验方法1. 材料处理：- 将藜属植物根尖或叶片固定于甲醛溶液中，室温下放置24小时。
- 将固定后的材料置于乙醇溶液中，梯度脱水。
- 将脱水后的材料进行酸解处理，以使染色体解旋。
2. 染色：- 将酸解后的材料进行染色，使用醋酸洋红染色剂进行染色体染色。
3. 探针标记与杂交：- 将5S rDNA和45S rDNA探针进行标记，标记方法采用地高辛标记试剂盒。
- 将标记后的探针与染色后的染色体进行杂交，杂交条件为60℃、24小时。
4. 洗涤与显色：- 将杂交后的染色体进行洗涤，去除未结合的探针。
- 使用地高辛标记试剂盒中的显色剂进行显色。
5. 显微镜观察与拍照：- 使用荧光显微镜观察杂交后的染色体，记录核型特征。
- 使用数码相机拍照，记录实验结果。
四、实验结果与分析1. 核型分析：- 通过荧光显微镜观察，发现藜属植物中存在二倍体（2n2x18）和四倍体（2n4x36）两种倍性。
- 藜麦和灰绿藜为四倍体，其余3种为二倍体。
- 核型公式分别为：藜麦（2n4x3634m）、灰绿藜（2n4x3632m）、藜（2n2x1816m）、菊叶香藜（2n2x1818m）、杂配藜（2n2x1816m2sm）。
2. 染色体特征：- 染色体主要由中部着丝粒染色体（m）和近中部着丝粒染色体（sm）组成。
- 核型类型除菊叶香藜为1B类型外，其余均为2B类型。
3. 双随体分布：- 在藜麦、灰绿藜及藜中，具有分布位置不同、数量不等的双随体。
4. 5S rDNA和45S rDNA位点：- 藜麦和灰绿藜的染色体上存在2对5S rDNA位点和1对45S rDNA位点。
植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。
所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。
材料取下后应立即固定。
取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。
300 ml量为例）1、先打开一个60℃左右的水浴锅。
2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。
3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。
4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。
5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。
6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。
7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。
二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。
注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。
2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。
注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。
3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。
植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。
所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。
材料取下后应立即固定。
取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。
300 ml量为例）1、先打开一个60℃左右的水浴锅。
2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。
3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。
4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。
5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。
6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。
7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。
二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。
注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。
2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。
注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。
3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。
4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。
5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。
注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。
0.85% NaCl 冰浴，30 分钟2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜50%乙醇后，材料应开始脱色。
/水 4℃，5小时2、100%乙醇 4℃，5小时3、100%乙醇 4℃，过夜注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。
两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。
室温，2小时2、50%乙醇/50% 二甲苯室温，1小时3、100% 二甲苯室温，1小时4、100% 二甲苯室温，1小时5、100% 二甲苯室温，1小时6、50% 二甲苯/50%石蜡 58℃，过夜（使用熔蜡台）后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。
石蜡（58℃），倾倒时避免产生气泡。
1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。
将折好的纸盒于氯仿（废氯仿可回收重复利用）中泡一会，再取出晾干。
包埋蜡块：先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。
用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。
用嘴吹气，使石蜡表面凝固形成一层薄膜时，再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。
约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。
包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。
二、载玻片和盖玻片的处理1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液（2%HCl+70%乙醇溶液：70 ml 无水乙醇+2 ml浓HCl+28ml H2O）浸泡过夜，流水冲洗干净。
2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖玻片依次经过这6个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯上烧干。
3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。
4、180℃烘5个小时。
5、待载玻片冷却，加4 ul多聚-L-赖氨酸（1mg/ml）于一端。
用盖玻片（已经过180℃烘5个小时处理）的一边接触液滴，进行涂片。
涂片时应观察到“虹膜”的形成。
注意：若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。
请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。
6、涂片之后放入37 ℃的烫板中干燥过夜（最短可以4小时，水干了即可），准备切片。
经过处理的载玻片应在一周内使用。
7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。
使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。
三、切片和展片1、修块。
将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。
用刀片将蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可（尽可能少留）。
2、切片。
切片的厚度为7-10 um。
在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。
3、展片。
将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上（注意分清哪一面涂有多聚赖氨酸），将蜡带的反面（注意正反面！）漂浮于其上放入烫板上（42℃）进行展片。
蜡带完全展开后（数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度），吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。
置于42℃烫板上干燥过夜。
4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。
植物组织RNA原位杂交第二部分 RNA探针的地高辛标记一、转录模板的线性化要转录的DNA（150-1200bp，无polyA尾）被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆位点的外端带有SP6、T7或T3 RNA多聚酶的启动子，如pSK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。
转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。
为防止转录出非目的的RNA，应选用产生5’端凸出（或平端？）的内切酶，酶切必须完全。
酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。
酶切体系：总体积 200 ulO 152或172 ulH210×Buffer 20 ul10×BSA 0或20 ul质粒（1ug/ul） 6 ul酶（10 u/ul） 6 ulRNase（10mg/ml） 6 ul1、质粒终浓度为0.1u g/u l，加入合适的内切酶及缓冲液（200 u l酶切体系），在合适的温度下保温（如37℃，2小时），电泳检查是否酶切完全。
酶切后可以加入等体积的水（200 u l），这样可以减少后面抽提时的损失（注意：此时应该以混合后的体积作为1倍体积）将3M的醋酸钠取出化冻2、酶切后，加入等体积的酚（Tris饱和的酚 pH 7.8，下层溶液才是酚）（200 u l）：氯仿（200 u l）（先加酚，振荡，再加氯仿，振荡）抽提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。
再加等体积的氯仿（400 u l）抽提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。
再重复一次氯仿抽提，取上清。
3、在上述水相中加入3M的醋酸钠（中和磷酸基团，有助于沉淀DNA），使终浓度达到0.3M（由最后所得的上清液的体积决定）。
约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇，置冰上1小时（推荐是-20℃过夜）。
4、样品取出，12000g离心，10 min。
弃上清，加400 ul 70%乙醇，颠倒混匀后再12000rpm离心 10 min。
把残液吸尽后，真空干燥（约1.5 min），重悬于水或1/10 TE（pH 8.0）溶液中使终浓度达0.5-1u g/ul（视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积），-20℃保存。
二、RNA探针的标记下午开始做，先将Buffer，DDT，ATP，GTP，CTP和Dig-UTP化冻，不同公司用各自的一套反应体系。
1、标记反应体系：（室温下，以T7RNA聚合酶为例。
）宝丽曼反应体系10 u l DEPC水（要根据模板加样量决定）2.5u l 10×T7转录缓冲液0.5u l RNA酶抑制剂（50u/u l）2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1 u l DNA线性模板（0.5-1u g）1 u l T7RNA聚合酶Total: 25 u lPromega的反应体系4-5u l DEPC水（要根据模板加样量决定）5 u l 5×T7转录缓冲液2.5u l DDT(100mM)2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1-2u l DNA线性模板(0.5-1u g，视模板浓度而定加样体积)0.5u l RNA酶抑制剂(40u/u l)1 u l T7RNA聚合酶(20u/u l)Total: 25 u lTakara的反应体系4.5u l DEPC水（要根据模板加样量决定）2.5u l 10×SP6转录缓冲液2.5u l DDT(100mM)2.5u l 0.1%BSA2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1.0u l DNA线性模板(0.05-0.5u g，视模板浓度而定加样体积)0.6u l RNA酶抑制剂(40u/u l)1.0u l SP6RNA聚合酶(10-50u/u l)Total: 25 u l此时将tRNA(100mg/ml)和3.8 M NH4Ac拿出来化冻并混匀。
2、37℃温育2 小时（此时可跑胶检测转录产物的长度，但多省略）。
3、终止转录反应：75 u l 1xMS2 u l tRNA(100mg/ml)(Sigma, R4251,500 units, Type XXI,Ribonucleic acid, transfer,放在-20℃的EP管；它在万一有RNAase的情况下，则可以保护转录的RNA，牺牲自己去被降解；而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失)1 u l DNA酶（无RNA酶污染的DNaseI(10u/u l)）4、37℃温育10分钟。
5、沉淀： 100u l 3.8 M NH4Ac（可增加离子浓度）600u l 乙醇（冰上预冷）6、-20℃过夜。
（或在干冰上10分钟，时间稍微长点没关系）。
配好明天用的70%乙醇/0.15M NaCl溶液，体积视标记的数量而定，于4℃冰箱存放。
