实验一培养基的配制及灭菌

实验一培养基的配制与灭菌一、目的掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。

二、方法步骤1、母液配制一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。

配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。

2、植物激素配制植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。

由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：IAA：先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。

NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。

2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。

细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶解后再稀释至需要浓度。

赤霉素：赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。

3、培养基配制按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化。

用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热使琼脂完全溶化，用蒸馏水定容至终体积，混合均匀后分装于培养器皿中，然后进行高压灭菌。

4、培养基灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。

培养基体积与灭菌时间的关系三、结果与分析1、培养基的母液配制情况。

2、培养基配制时的注意事项。

四、提交实验报告附：MS培养基配方。

实验一植物培养基的配制、灭菌与保存一、实验目的1、学习和了解相关仪器的操作步骤和注意事项；2、学习和了解培养基母液的配制方法；3、掌握培养基的配制方法；4、学习和了解培养基、器皿和相关设备的灭菌方法。

二、主要用具和仪器设备烧杯（1000mL 、500mL 、100mL 、50mL ）；量筒（2000mL 、1000mL 、500mL 、250mL 、100mL 、50mL 、25mL 、10mL ）；容量瓶（1000mL 、500mL 、250mL 、100mL 、50mL 、25mL ）；试剂瓶（1000mL 、500mL 、200mL 、100mL 、50mL ）；培养基瓶（三角瓶）（1000mL 、500mL 、200mL ）；玻璃棒等。

1、玻璃器皿二、主要用具和仪器设备油性标记笔、药勺、称量纸、棉塞、锡箔纸、移液枪（5mL 、1mL 、200µL 、100µL ）和对应的枪头、移液管（5mL 、2mL 、1mL 、0.5mL ）和洗耳球、电子天平（感量为0.1 mg 、10 mg ）、pH 计、灭菌锅、微波炉、磁力搅拌器、电磁炉、超净工作台、冰箱、冰柜等。

2、用具和仪器设备三、实验药品NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Na2EDTA、FeSO4·7H2O、甘氨酸、盐酸硫氨素（V-B1）、·4H2O、盐酸吡哆素（V-B6）、烟酸、肌醇、MnSO4ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NAA、6-BA、KT、2,4-D、琼脂、蔗糖、NaOH、HCl。

四、实验内容培养基配制方案MS1（500mL）：MS基本培养基+2,4-D 2 mg/L + KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L（烟草愈伤组织诱导）;MS2（800mL）：MS基本培养基+NAA 0.2 mg/L + 6-BA1 mg/L+蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L（烟草苗的微繁殖）;MS3（500mL）：MS基本培养基+NAA 1 mg/L + KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L（烟草细胞悬浮培养）。

实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。

2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。

二、实验器材1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。

2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。

三、实验方法(一)配制培养基的基本过程:(1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中;(2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。

要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分;(3)调pH值:按配方要求调节;(4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。

(5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

(6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。

制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。

也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。

棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。

如制作时不慎沾上培养基则不可再用。

(7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用笔注明培养基名称、组别、日期。

实验一、培养基的制备和消毒灭菌培养基的配制1.培养基：人工配制的供微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的营养基质。

2.培养基的配制原则（1）目的明确：不同微生物所需营养基质不同，配制培养基的目的也有不同。

（2）营养协调：营养成分的比例和浓度要适当。

（3）理化适宜：渗透压、pH和氧化还原电位。

（4）经济节约。

实验步骤---斜面培养基的制备和灭菌计算→称量→加热溶化→调pH →过滤（可省略）→分装→加塞（附棉塞制作）→包扎(皮筋或绳子)→灭菌→摆斜面→无菌检查。

1.称量按照配方，准确称量各成份放于烧杯中。

对于不是粉状药品（如牛肉膏），应用烧杯和玻璃棒称量。

2.配制（1）向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。

（2）如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

一般要求琼脂沸腾3次，完全熔化后，补足所失水分。

3.调节pH值培养基溶解后，用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1M HCl和1M NaOH），要缓慢少量且多加搅拌。

培养基配方为自然pH时，不用调节。

4.过滤用滤纸或多层纱布，无特殊要求时可省去。

5.分装（1）将培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。

固体培养基要趁热装。

（2）分装量①斜面：装量为管长的1/5。

②液体培养基：装量为管长的1/4。

③半固体培养基：装载量为管长的1/3。

（3）注意分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。

6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。

培养基做完后，要求在2-4小时内灭菌，否则会被污染。

7.摆斜面灭菌完毕，冷却到60℃左右再摆斜面，以免产生过多冷凝水。

配制培养基时注意事项1.称量要准确，取药品的角匙不能混用。

2.加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出,（每加热30s关掉电源，开盖看一次）。

3.蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。

5.节约药品。

实验二细菌的简单染色和革兰氏染色革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。

试验1 培养基制备、消毒灭菌倒平板（共6课时）一、试验目1.了解配制培养基原理, 并掌握配制培养基通常方法和步骤。

2.学习多个常见培养基配制、分装和灭菌操作方法.二、试验器材1.药品及试剂:可溶性淀粉, KNO3, K2HPO4·3H2O, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, 1mol/L NaOH, 琼脂, 牛肉膏, 蛋白胨, NaCl, 马铃薯2.仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸(5.5-9.0) 、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、试验内容1.分组配制高氏一号培养基300ml。

配方:可溶性淀粉20g NaCl 0.5g、KNO3 1g 、K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g 琼脂15-25g 水1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培养基100ml配方:牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂20g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制马铃薯培养基100ml配方:马铃薯200g 蔗糖20g 琼脂20g 水1000ml pH自然4.包扎材料: 试管, 培养皿, 涂布棒, 吸管, 枪头盒等。

5.灭菌。

6.摆斜面, 倒平板, 放冰箱。

四、方法步骤（一）培养基制备与分装1.称量按培养基配方百分比依次正确地称取药品。

可溶性淀粉先用少许热水溶化后再加入其她成份, 补足所需水分, 混匀后加入琼脂。

2.熔化在沸水浴锅中加热熔化。

3.调pH 用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。

4.过滤趁热用多层纱布过滤5.分装将溶化固体培养基趁热加至漏斗上, 装试管时, 注意管口不要沾上培养基。

液体分装装量不超出试管1/4, 固体分装装量不超出试管1/5, 分装三角瓶量不超出三角瓶容积二分之一, 半固体分装装量为试管1/3, 灭菌后垂直待凝。

培养基的配制与灭菌一、实验目的1. 了解一般培养基配制原理，掌握培养基常规配制程序。

2. 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项，掌握实验室各种灭菌技术及玻璃器皿的包装方法。

二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料，主要含有微生物生长繁殖所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子及水分，并要求具有适宜的pH值、合适的渗透压等。

由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料各有差异，但一般配制程序却大致相同。

三、实验材料1. 器皿及材料天平、称量纸、钥匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、橡胶塞、试管架、三角瓶、移液管、洗耳球、培养皿、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、电炉、灭菌锅等。

2. 药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、水、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。

四、实验流程称药品→溶解→调pH值→加琼脂融化（补水，固体培养基用）→过滤（可省略）→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查。

五、操作步骤1. 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2. 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。

待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。

（如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

）3. 调节pH用1mol/L NaOH或1mol/L HC1溶液调至所需pH。

注意pH值不要调过头，以免回调，否则会影响培养基内各离子浓度。

4. 溶化琼脂琼脂加入后，置电炉上一边搅拌一边加热，直至琼脂完全溶化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。

注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

5. 过滤分装有时需用滤纸或纱布趁热过滤，以利于观察结果。

实验一培养基的配制与灭菌一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。

培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。

一般要配下列母液：1、微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000×2、有机化合物母液：通常配成100×3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。

浓度为1000×4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。

5、10×大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。

用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。

(二) 培养基的灭菌：培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。

灭菌方法下列几种：1．高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1k g/cm2)的压力下持续约20分钟。

2、过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22μm(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。

此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。

3. 60Coγ射线法：用γ射线过量照射以灭菌。

可用于大量灭菌，但设备昂贵。

三、仪器设备及用具(一)仪器设备万分之一电子天平百分之一电子天平超净工作台高压锅酸度计磁力搅拌器及搅拌子不锈钢过滤器玻璃蒸馏水器家用冰箱(二)用具烧杯：100ml×1，500ml×1 ；量筒：100ml×1，250ml×1磨口试剂瓶：100ml×1，500ml×1；带盖试剂瓶：500ml×2三角瓶：100 ml×1，250 ml×1药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干(三)试剂1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯）琼脂粉N6大量：KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2P O4 (NH4)2SO4B5微量：KI H3BO3MnO4·H2O ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O CoCL2·6H2O Na2EDTA FeSO4·7H2OB5有机：盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸肌醇谷氨酰胺水解酪蛋白脯氨酸2、4－D 6-BA NAA五、实验步骤（一）配母液1、B5微量元素母液（1000×/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。