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凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。
最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。
对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。
现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：（2）冰浴5min后，加入1μ探针。
（对照组加1ul对照探针）（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）（2）按标准步骤制备凝胶。
（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。
凝胶迁移阻滞实验（EMSA）实验操作方法及注意事项凝胶迁移阻滞实验（EMSA）转载丁香园大神的帖子！非常详细！EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的! EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA 操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否!简介:EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
发展:从发展史来看,这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,所以从定购到标记再到做完试验,必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术,这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术.在实践中没多久,地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷,标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术.配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题,到目前为止, 生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用!EMSA试验成功的关键因素:1.1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!!3.探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点:关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20μl脱气10min10% AP（过硫酸氨）120μl总量20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)l 2×Blocking Buffer（2×封闭液）(4 oC)l 5×Washing Buffer（5×洗涤液）(4 oC)l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)3. 结合反应每次结合反应需1-5μl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15μl （1）结合反应体系：10X 结合反应液1.5μlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl细胞核提取物* ? μl双蒸水* ? μl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5μl总量15μl混匀室温静置20分钟或以上。
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品VER. 3.112005年2月目录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
本非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。
与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。
目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。
每种试剂盒均经过多次实验测试，并已优化了DNA-蛋白转录因子的结合条件。
EMSA实验总结实验原理：凝胶迁移实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究蛋白与核酸（DNA/RNA）相互作用的技术。
实验步骤：（参考碧云天化学发光法EMSA 试剂盒）1.蛋白：利用原核表达蛋白，进行纯化后测定蛋白的浓度（BSA法测定）。
4 ℃保存。
注：提取的植物总蛋白（贝博试剂盒）进行EMSA实验，蛋白易滞留在点样孔，具体原因尚不明确。
2.探针：合成biotin标记的探针、未标记的探针、突变探针（需要HPLC纯化）。
注：合成单链探针，使用时1:1混合，利用PCR仪合成双链探针。
具体步骤：探针根据使用浓度用DEPC水稀释，正链：反链 = 1:1 ,PCR程序：75 ℃30 min，以后每个循环降低0.1 ℃，直到0 ℃。
3.6 % EMSA非变性胶：制胶前需要把制胶模具清洗干净，不能有SDS残留。
一块胶的用量（6 mL），不用制浓缩胶。
5 × TBE 1 mL30 % acrylamide/bisacrylamide 2 mL40 % 甘油 625 μLO 3.125 mLdd H210 % 过硫酸铵 150μLTEMED 5 Μl4.EMSA结合反应：（20 µl反应体系，蛋白和探针根据实验需求和预实验进行调整）阴性对照反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl标记好的探针样品反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子标记好的探针探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的探针标记好的探针突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的突变探针标记好的探针Super-shift反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子目的蛋白特异抗体标记好的探针在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。
最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。
对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。
现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml（2）冰浴5min（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%（2（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。
（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。
(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。
6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册 本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品目录号 产品名称 包装SIDET001非放射性 NF-KB EMSA36 次结合反应SIDET003非放射性 STAT3 EMSA36 次结合反应SIDET004非放射性 STAT5 EMSA36 次结合反应VER. 3.112005年2月目 录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。
与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。
目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。
EMSA操作步骤EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移转移实验）是一种常用的生物技术方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
EMSA可以在体外检测和分析DNA结合蛋白质的形成复合物。
下面是EMSA的基本操作步骤。
1.DNA探针制备首先，需要根据研究目标设计和合成DNA探针。
DNA探针是由与目标蛋白质结合的DNA序列组成的DNA片段。
这个DNA片段可以从已知的基因组DNA中扩增，或者使用人工合成的DNA序列。
2.DNA探针标记将DNA探针标记上荧光或放射性同位素等标记物，以便在电泳中进行检测和定量。
常用的标记方法包括使用荧光染料标记或使用放射性核素标记。
标记DNA需要进行纯化和测定其浓度。
3.蛋白质提取从感兴趣的组织或细胞中提取蛋白质。
常用的方法包括细胞溶解、裂解、超声波溶解等，使用络合剂、蛋白酶抑制剂和还原剂等添加剂来保护蛋白质免受降解。
4.蛋白质净化通过离心、过滤、洗涤等方法获得纯化的蛋白质。
纯化过程中，也需要添加一些保护蛋白质的添加剂。
5.EMSA实验条件优化对EMSA反应条件进行优化，以获得最佳结果。
例如，调节反应的pH 值、离子浓度、反应温度、反应时间等。
6.反应体系制备将合适的缓冲液、DNA探针、蛋白质溶液和其他必要的添加剂混合在一起，形成EMSA反应体系。
通常，反应体系中还需要添加一些非特异性竞争性DNA片段，以确保特异性结合。
7.EMSA实验进行将EMSA反应体系加载到预先制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，进行电泳分离。
电泳过程中，DNA片段会被蛋白质结合形成DNA-蛋白质复合物。
较大的复合物会迁移较慢，而较小的自由DNA片段会迁移较快。
8.凝胶电泳分析将电泳板取出，进行染色或检测DNA探针的标记物，以可视化复合物和自由DNA片段。
常用的染色方法包括乙酰亚胺染色、溴化乙锭染色等。
另外，也可以使用荧光成像系统、放射性成像系统等仪器进行检测和定量。
