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大肠杆菌表达纯化蛋白大肠杆菌是一种常见的细菌，被广泛用于表达和纯化蛋白的研究中。
本文将探讨大肠杆菌表达纯化蛋白的方法和应用。
一、大肠杆菌表达纯化蛋白的方法大肠杆菌表达纯化蛋白的方法主要包括以下几个步骤：1. 质粒构建：首先需要构建包含目标蛋白基因的质粒。
这通常包括选择一个适当的表达载体，将目标蛋白基因克隆到质粒中，并添加相应的启动子和信号序列，以实现高效的蛋白表达。
2. 转化大肠杆菌：将质粒导入大肠杆菌中，使其成为宿主细胞。
常用的转化方法包括化学转化、电转化和热激转化等。
3. 诱导表达：通过添加适当的诱导剂，如IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷），诱导大肠杆菌开始表达目标蛋白。
4. 细胞培养：大肠杆菌在适当的培养基中进行培养，以提供足够的营养物质和条件来支持蛋白的表达。
5. 细胞破碎：培养达到一定密度后，通过破碎细胞膜的方法将细胞内的目标蛋白释放出来。
常用的方法包括超声波破碎、高压破碎和化学破碎等。
6. 蛋白纯化：通过一系列的层析、过滤和浓缩等步骤，从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
大肠杆菌表达纯化蛋白的方法被广泛应用于生物医学研究、药物开发和工业生产等领域。
1. 生物医学研究：通过大肠杆菌表达纯化蛋白，可以获得大量高纯度的目标蛋白，用于研究其结构、功能和相互作用等。
这对于研究蛋白质的生物学特性、疾病机制以及药物研发具有重要意义。
2. 药物开发：大肠杆菌表达纯化蛋白广泛应用于药物的筛选和研发。
通过表达和纯化目标蛋白，可以用于药物靶标的筛选、药物的活性评价以及药物的结构优化等。
3. 工业生产：大肠杆菌表达纯化蛋白的方法也被应用于工业生产中。
通过大肠杆菌表达大量的目标蛋白，可以用于生产酶类、抗体和其他重要蛋白制剂。
三、大肠杆菌表达纯化蛋白的优势和挑战大肠杆菌作为常见的宿主细胞，表达纯化蛋白具有以下优势：1. 高表达水平：大肠杆菌能够高效表达目标蛋白，产量较高。
SUMO蛋白纯化步骤
1.制备大量表达蛋白
选择合适的载体，将SUMO蛋白的序列与目标蛋白的序列连接，并在
适当的表达系统中大量表达。
通常使用大肠杆菌（E. coli）作为表达宿主。
2.细胞培养与蛋白表达
将经过质粒转化的大肠杆菌菌株培养在含有适当抗生素的培养基中，
以促进质粒的稳定复制。
待菌液浓度达到一定程度后，添加诱导剂（如IPTG）刺激蛋白表达。
培养细胞经过一定时间后，收集菌液（菌体）。
3.细胞破碎
转移到离心管中的菌体通过离心沉积，弃去上清液，然后用适当的缓
冲盐溶液进行细胞破碎，并添加适量的酶抑制剂以保护目标蛋白的完整性。
破碎的方法可以选择超声波、高压均质器等。
4.尘埃蛋白去除
利用离心将细胞碎片和蛋白质分离。
离心渣中包含大部分目标蛋白，
并且杂质蛋白会随着上清被移除。
杂质蛋白可以通过滤过或离心的方式去除。
5.亲和纯化
6.洗脱目标蛋白
使用适当的冲洗缓冲液，从亲和柱上洗脱融合蛋白，通常增加一些融
合蛋白如六组氨酸来洗脱。
在该步骤中，目标蛋白可以与SUMO蛋白分离，并纯化出来。
7.反复纯化和洗脱
如果目标蛋白的纯度还不够高，可以反复进行纯化和洗脱步骤，以进
一步纯化目标蛋白并去除净杂质。
8.浓缩和储存目标蛋白
使用合适的方法如超滤或共沉淀将纯化后的目标蛋白浓缩到所需的浓度。
根据蛋白质稳定性的要求，决定是否添加保护剂并存储在适当的缓冲
液中。
大肠杆菌表达蛋白的纯化方法
1.培养大肠杆菌，使其表达目标蛋白。
2. 收集菌液，离心去除细胞。
3. 用磷酸盐缓冲液洗涤菌体，破坏细胞壁并释放目标蛋白。
4. 通过离心去除细胞壁碎片和杂质。
5. 用柱层析技术（如亲和层析、离子交换层析或凝胶过滤层析）将目标蛋白分离纯化。
6. 最终通过紫外线检测纯度和质量，得到高纯度的目标蛋白。
该方法简单、高效，适用于大规模生产和工业化生产。
同时，该方法还可根据不同蛋白的特性进行优化和改进，以满足不同需求。
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蛋⽩表达与纯化-真核表达
真核表达的⽅式：包括原核蛋⽩表达与纯化、酵母蛋⽩表达与纯化、昆⾍细胞蛋⽩表达与纯化、哺乳动物细胞蛋⽩表达与纯化。
蛋⽩表达从哪⼀步开始呢？
1. 从基因合成开始，只需要提供具体的序列；
2. 提供cDNA基因模版，最后提供测序报告，以证明序列是正确的；
3. 提供质粒，如果是T载体，需要从构建载体开始，如果是PET28a和PET32a或其他可以直接⼩量诱导的质粒，可以从纯化开始；
4. 提供菌株，从纯化开始（菌株存放时间长可能活性会变差）
根据客户的需求，我们提供从基因合成，载体构建，基因表达，蛋⽩纯化、检测等⼀站式服务。
目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
2、保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。
3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。
4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm 离心1min，弃尽上清，-200C保存。
160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。
大量表达：1、挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。
3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
（对照）4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C 保存。
大肠杆菌系统蛋白表达纯化流程英文回答：Introduction:The expression and purification of proteins in Escherichia coli (E. coli) is a commonly used method in molecular biology research. E. coli is a well-studied and easily manipulated organism, making it an ideal host for protein expression. In this article, we will discuss the general workflow for the expression and purification of proteins in E. coli.Expression of the target protein:1. Gene cloning: The first step is to clone the gene encoding the target protein into an expression vector. This vector contains a promoter that drives the expression of the gene in E. coli.2. Transformation: The recombinant expression vector is then introduced into E. coli cells through a process called transformation. This results in the production of many E. coli cells carrying the target gene.3. Expression induction: The transformed E. coli cells are grown in a suitable culture medium until they reach a specific growth phase. At this point, expression of the target gene is induced by adding a chemical inducer or by changing the growth conditions.4. Protein expression: The induced E. coli cells produce the target protein, which can either be present in the soluble fraction or form insoluble aggregates called inclusion bodies.Protein purification:1. Cell lysis: The E. coli cells are harvested by centrifugation and then lysed to release the proteins. Various methods can be used for cell lysis, such as sonication, freeze-thaw cycles, or enzymatic digestion.2. Removal of cell debris: The cell lysate is then clarified by centrifugation to remove cell debris and insoluble material. The resulting supernatant contains the target protein along with other cellular components.3. Protein purification: Different purification techniques can be employed to isolate the target protein from the crude lysate. These techniques include affinity chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, and hydrophobic interaction chromatography. The choice of purification method depends on the properties of the target protein.4. Protein concentration: After purification, thetarget protein is often in a dilute solution. Concentration can be achieved by using techniques such as ultrafiltration or precipitation with ammonium sulfate.5. Protein characterization: The purified protein should be characterized to confirm its identity and purity. Techniques such as SDS-PAGE, western blotting, and massspectrometry can be used for protein analysis.Conclusion:The expression and purification of proteins in E. coli is a well-established and widely used technique in molecular biology research. The workflow involves gene cloning, protein expression, cell lysis, protein purification, concentration, and characterization. By following this general procedure, researchers can obtain purified proteins for further analysis and functional studies.中文回答：简介：大肠杆菌（E. coli）中的蛋白表达和纯化是分子生物学研究中常用的方法。
14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
2、第二天，小心地挑取培养菌落中的单克隆，加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中，放在37℃的摇床中培养过夜。
3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中，于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6～0.8 之间，就可以拿出，把菌液放置于4℃冷却菌液20～30min。
4、在超净台中，加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM，诱导蛋白表达，于18℃摇床中培养6-8h。
5、诱导完成以后，8000 rpm 离心10min，沉淀收集菌体。
6、在沉淀后的细菌菌体中，加入lysis buffer（10 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mMNaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）中重悬，1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液，进行超声破碎，然后12000rpm 离心20min，离心后取上清。
7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中，于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。
8、加入4 mL 的wash buffer（300 mM NaCl，20 mM 咪唑，50 mM NaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂），在冰上洗4 次，每次孵育10min。
9、加入elution buffer（250 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，用NaOH调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）洗脱重组蛋白4 次，每次用500μl。
14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
动等原因，要及时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。
8、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm，15min，4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。
）9、纯化上清---摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。
第一章蛋白表达纯化
一、诱导表达分析
1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;
2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;
3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;
4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化
2.1重组蛋白的提取
2.1.1 提取缓冲液
20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法
1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30
minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；
3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分
析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
8)样品上样前必须完全溶解并用稀释或换液的方法调整缓冲液。
9)如样品暂时不使用应存于-20 °C。
融合蛋白
2.2 Ni柱纯化(His)
6
1)缓冲液：
a、S tart buffer: 0.02 M sodium phospate, 0.5 M NaCl 5-50 mM imidazole pH
7.4
b、Elution buffer: 0.02 M sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole
pH 7.4
Note: 如recombinant (His)6-tagged protein 表达成包涵体还需加入6 M guanidine hydrochloride or 8 M urea 。
2)层析柱准备：用Start buffer平衡10柱体积
3)样品纯化：
a. 用start buffer平衡5-10柱体积；
b. 上样；
c. 用start buffer洗涤5-10柱体积；
d. 用Elute buffer洗脱10-20柱体积；
4)层析柱清洗(CIP)：2 M NaCl反向清洗0.5个柱体积，洗15分钟；1 M NaOH 以
1ml/mim反向洗40min。
2.3 GST柱纯化GST融合蛋白
1) 缓冲液：
a.Start buffer: PBS pH 7.4
b. Elution buffer: 50mM Tris HCl，10mM reduced glutathione pH 8.0
2) 样品纯化：
a.用start buffer平衡5-10柱体积；
b.上样；
c.用start buffer洗涤5-10柱体积；
d.用Elute buffer洗脱10-20柱体积；
3) 层析柱清洗(CIP)：6 M guanidine hydrochloride清洗2个柱体积。
2.4 离子交换层析(IEC)
1) 缓冲液：
a、S tart buffer: See Table 1
b、Elution buffer: Start buffer + 1 M NaCl
Table 1. Suggested buffer for various pH intervals
2) 样品准备：样品需用脱盐柱换成start buffer。
3) 样品纯化：
a、用start buffer以1 ml/min洗涤5ml；
b、用elution buffer以1 ml/min洗涤5ml；
c、用start buffer 5 - 10 ml平衡层析柱；
d、上样；
e、用start buffer 5 - 10 ml洗涤层析柱；
f、用elution buffer以0-100%的阶段或连续梯度洗脱20ml以上。
4) 层析柱清洗(CIP)：
2 M NaCl以1ml/mim反向清洗10个柱体积；1 M NaOH 以1ml/mim反向洗40min。
2.5 凝胶过滤(GF)
Separation range (Mr)
<10 000 (Superdex 30 pg)
3 000–70 000 (Superdex 75 pg)
10 000–600 000 (Superdex 200 pg)
Column volume 319–330 ml
Sample volume Up to 13 ml
Recommended flow rate 2.5ml/min
Max. flow rate 4.25ml/min
Maximum pressure 0.5 MPa, 5 bar, 73 psi
pH stability
long term and working range 3–12
short term 1–14
Solutions in which the media is stable
1 M acetic acid
1 M sodium hydroxide
8 M urea
6 M guanidine hydrochloride
30% isopropanol
30% acetonitrile
70% ethanol
Storage
20% ethanol
1) 缓冲液：
根据需要使用相应的缓冲体系。
通常为了减少非特异性吸附缓冲液一般需加入至少0.15 M NaCl。
PBS(pH7.4)是常用的缓冲液。
2) 层析柱准备：上样前用2柱体积elution buffer平衡。
3) 层析柱清洗(CIP)：0.5 M NaOH以0.5ml/min反向清洗1-2 hours 。
三、蛋白浓度测定（Bradford法）
1、取7根试管，按表1进行配比
2、配比后，室温下静置5min后，以0号管为对照，测定OD595。
以BSA 含量为横坐标，对应的吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
3、待测蛋白质浓度的样品，取其适量（以不超过标准曲线范围为限），用0.15mMNaCl补加体积至100ul，测定OD595。
根据标准曲线，计算出相应的蛋白质含量。
表1：Bradford法测定蛋白质浓度
Table 1:Protein concentration assay by Bradford method
0 1 2 3 4 5 6
1mg/mlBSA(ul) 0 10 20 40 60 80 100
0.15mMNaCl(ul) 100 90 80 60 40 20 0
Bradford工作液(ml) 5 5 5 5 5 5 5。
