03细胞生物学实验技术1

第一节显微技术METHODS AND TECHNIQUES OF CELL BIOLOGY第一节显微技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。

电子显微镜：以电子束为光源。

扫描隧道显微镜：隧道效应（隧道电流）Robert Hooke1690年1720年1725年1760年1790年1881年1840年1890年Large Student Microscope made byCharles ChevalierBausch & Lomb Investigator microscope –circa 189317521812改进了体视显微镜。

1886并改进了油浸物镜，至此成熟。

microscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。

1932电镜，的商品电镜。

电子显微镜下的蚊子1981验中心（镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

Cs atoms (red) on theGaAs(砷化镓)surface(blue).诺贝尔奖：Ernst Ruska，Gerd Binning和Heinrich Rohrer显微图片分别由普通光学显微镜、电子显微镜和扫描隧道显微镜拍摄。

按从上到下、从左到右的顺序，他们分别是：集成电路的局部、青霉、用原子排列而成的“原子”、神经细胞、T4噬菌体、蜜蜂关节局部、月尘、圆藻、硅藻土。

—★光学显微镜的种类☆可见光显微镜不可见光显微镜——利用390nm以下（紫外光显微镜），760nm☆明视野显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜。

☆相差显微镜、干涉显微镜、微分干涉反差显微镜、偏光显微镜。

☆倒置显微镜、实体显微镜、比较显微镜、激光扫描显微镜上述各种显微镜都是在一般复式显微镜的基础上设计改造的，是依研究目的不同而制造的具特殊功能的显微镜。

☆基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统尼康E-600显微镜学显3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。

R=0.61λ/N．A．－－其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率（数值孔径）＝ｎsinα，n=介质折射率；α=镜口角（孔径角）（样品与物镜有效直径的边缘的张角）。

思考：如何提高显微镜的分辨能力？名波长（显微镜的几个光学特点：–制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。

––放大倍数目镜放大倍数物镜放大倍数物=160 mm（标准光学筒长）/F物总放大倍数MF总=标准光学筒长/F，物·250/F，目。

目不能太短，因为人眼瞳孔要与出射光孔重合，一般在约在（）也不能无限延长，所以只有靠减小大倍数。

由于分辩率（）的限制，光学显微镜总放大倍数也不能随，物的减小而无限增大。

即光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2mm）大小，便能观察该物体。

1000/0.2继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。

☆有效放大：上限：物镜镜口率×下限：物镜镜口率×250；可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的N.A适应于物镜的N·A不能充分发挥。

☆正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。

显微镜适合的放大倍数为NA倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中，目镜有效放大倍数为：M=目镜倍数（×B=NAO=NA焦点深度是调焦看清楚某一物点时，不仅这一点清楚，此点的上下两侧也能看清楚，能看清楚的厚度称为焦点深度。

以下式表示：d=Kn/M·NAK常数，约从上式看出，放大倍数愈高，数值孔径愈大，则焦点深度愈浅。

工作距离离。

在物镜孔径一定的条件下，工作距离越小，孔径角就愈大，数值孔径也越大，所以高倍镜工作距离很小。

镜像亮度和视场亮度镜像亮度：指镜下图像的亮度。

视场亮度：镜下整个视场的明暗程度。

除与目、物镜有关外，还与聚光镜、光阑、反光镜和光源有关。

反差（镜有所不同。

在光镜（光学像）：由于被检物各部分结构不同，因而吸收或反射光线强弱程度差异而引起在电镜（电子像）：不同散射度而引起被检物之间不产生色的反应，在像中显示出来的仅是浓淡差别）。

（二）荧光显微镜microscope特点：光源为紫外光或蓝紫光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。

用于观察能激发出荧光的结构。

用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），Fluorescence image of epithelial cell,DNA in blue and Microtubules in green（三）激光共聚焦扫描显微境LaserLCSM•观察方式：以荧光为主•光源：激光（紫外、可见光、近红外）•照明方式：点照明、逐点扫描•成像方式：共聚焦、逐点成像•输出：实时观测•多重染色样品的观察laser confocalLCSM Image of a Xenopus Melanophore（非洲爪蟾的黑素细胞）microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)/（四）暗视野显微镜聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。

可观察分辨率比普通显微镜高（五）相差显微镜（把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

1.环形光阑（间。

2.相位板（相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟原理用途：观察未经染色的玻片标本（六）偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。

光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。

载物台是可以旋转。

淀粉2是最实用的一种方法双折射O光（寻常光）——遵守折射定律CB o eD eo（七）微分干涉差显微镜interference contrast microscope （DIC ）1952用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。

标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

DIC 显微镜下的硅藻（伪彩色）较大的细胞器，如核、线粒体等基因注入、核移植、转基因等的显微操作epithelium seen with different types of LM.inverse microscope物镜与照明系统颠倒，一般在载物台之下，倒置在载物台之上，用于，通常具有相差物镜，有的莱卡倒置显微镜（九）当代显微镜的发展趋势自从取得飞跃发展并在生物学领域中得到广泛的应用，利用电镜人们不但可以观察到各种病毒的形态结构以及细胞器的微细结构，还能观察到许多生物大分子，甚至看到了单个重金属原子。

目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。

此外，将电镜与计算机连用，对图象进行信息处理也取得了很大进展。

总之，电镜已成为研究生物学的有力工具，必将发挥越来越大的作用。

当电子入射至样品时，有下列几种情形：1 其中一部分电子几乎不损失其能量，在样品表面被散射回来，这部分电子称背散射电子。

穿过样品而成为透射电子（TE）。

吸收，称为吸收电子。

面，产生出能量很小的所谓二次电子（SE），其中也包括由于俄歇效应而产生的具有特征能量的一种二次电子出）电镜的种类如果利用电子穿透样品成象而设计成电镜，则为透射式电子显微镜，反映样品内部的状况。

描式电镜，反映样品的表面立体形貌。

另有隧道式扫描电镜，透射扫描电镜和超高压透射扫描电镜，作为特殊观察用。

利用背散射电子的衍射图像可研究样品的晶体学特征。

不同的元素可以发出不同的特征X射线，据此可对样品进行成分分析。

以电子束作光源，电磁场作透镜。

波长与加速电压由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等分辨力用于观察超微结构（光（（transmission electron microscope, TEM 1. 原理电子显微镜的基本构造电镜与光镜光路图比较利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化不要求真空玻璃透镜可见光（400-200nm LM TEM 显微镜光镜与电镜的主要透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRONMICROSCOPE 内质网透射电镜图（伪彩色）2、制样技术1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm 的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome ）制作。

通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

用于电镜观察下的生物样品制备过程示意图超薄切片的特点：a.细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失或添加等人工效应；b.切片厚度在500埃左右，最多不超过1000埃（1mm 厚的样品切成20000片；一个一般大小的细胞要切成300片）；2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm 左右。

Negative Stained Actin肌动蛋白纤维的负染电镜照片原理又称阴性反差染色，借助染色剂的衬托，增加背景对电子的散射，使样品相对地透过较多的电子，最后在荧光屏上形成暗背景下的“亮像”。

线粒体基粒、核糖体和蛋白质及其组成的纤维甚至病毒的精细结构。

亦称冰冻断裂。

标本置于干冰或液氮中冰冻。

然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。

向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。

然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（冷冻断裂－蚀刻复型技术示意图3.扫描电子显微镜（20世纪60年代正式问世，用来观察标本表面结构。

原理：扫描电镜是用聚焦电子束（高能电子）在试样表面逐点扫描成像。

成像信号可以是二次电子、背散射电子或吸收电子。

其中二次电子是最主要的成像信号。

聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射（以及其它物理信号），二次电子发射量随试样表面形貌而变化。

二次电子信号被探测器收集显像管栅极，调制与入射电子束同步扫描的到反映试样表面形貌的二次电子像。

透射电子显微镜；扫描电子显微镜扫描电镜扫描电镜具有以下的特点(1) 可以观察样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm直径为～30mm的大块试样(在半导体工业可以观察更大直径)，制样方法简单，能够直接观察样品表面的结构不用切成薄片。

(2) 场深大、三百倍于光学显微镜，适用于粗糙表面和断口的分析察；图像富有立体感、真实感、易于识别和解释。

放大倍数变化范围大，一般为～1000000的普查和高倍下的观察分析。