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两种化学诱导表达载体的构建及VGCfE：Gus在烟草中的瞬时表达分析

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两种化学诱导表达载体的构建及VGCfE：Gus在烟草中的瞬时表
达分析
水稻是我国主要的粮食作物之一,为了有效稳定两系法杂交水稻制种过程中不育系在低温条件下的不育特性,本课题组拟以水稻育性相关基因OsUdt1作为调控靶基因,构建化学诱导植物干扰表达载体p3301VGCfE:Udt1i和报告基因表达载体p3301VGCfE:Gus,转化至相应的植物材料中,为进一步探讨化学诱导表达系统VGCfE在水稻育性转换中的调控作用奠定理论基础和实验依据。

本文完成了以下研究工作：1.化学诱导植物干扰表达载体p3301VGCfE:RNAi的构建本实验根据Genebank中水稻基因组七号染色体的序列,确定水稻Y58S中存在OsUdt1基因,并根据比对结果以及Genebank中提交的信息确定OsUdt1—3’UTR的序列,设计特异性引物,从水稻Y58S基因组DNA中扩增得到长约450bp的OsUdt1—3’UTR 的基因片段,经过Blast比对确定得到的片段与预期一致。

通过连接酶非依赖性克隆(LIC),分别将两段3’UTR以相反的方向连接到GA20oxidase第一个内含子的两端构建pUCC—Udt1i载体。

构建干扰片段后,因酶切位点受限,用RF克隆的方法将3’UTR—intron—3’UTR连接到已构建的载体p3301VGCfE上,经PCR检查确认植物干扰表达载体构建完成。

2.化学诱导植物表达报告基因载体p3301VGCfE:Gus的构建在合成载体pUC57—4635S后,通过与p1381z多克隆位点的比较,选择两个相同的酶切位点,对载体和片段进行酶切消化,酶切后在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段4635S 连接到载体p1381z上,通过PCR及测序检测确定目的片段连到载体上。

根据LIC 的原理设计特异性引物扩增46 35S—Gus片段,通过连接酶非依赖型克隆将目的片段连接到已构建的载体p3301VGCfE上,经PCR检查确认植物表达报告基因载体
构建完成。

3.农杆菌介导报告基因植物表达载体p3301 VGCfE:Gus的转染烟草通过农杆菌的介导将已构建的载体p3301 VGCfE:Gus转入烟草叶片中,在诱导剂methexyfenozide的诱导作用下诱导报告基因Gus的表达,通过Gus染色进行观察。

与对照组相比,转基因的叶片有Gus基因表达,对照组则没有Gus基因表达。

证明诱导系统在诱导剂的作用下诱导Gus基因的表达。

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新型瞬时报告载体pRSET_EGFP的构建及表达

新型瞬时报告载体pRSET_EGFP的构建及表达

新型瞬时报告载体pRSET -EG FP 的构建及表达逯家辉,孟庆繁,高朝辉,王艳平,王校楠,徐岩,麻越佳,杨亦代,滕利荣(吉林大学生命科学学院,吉林长春130012)摘要:目的:利用分子生物学技术和方法将pRSET -B 质粒改建为带有绿色荧光蛋白(G FP )突变体基因(G FP -S65T )的新型瞬时表达载体pRSET -EG FP ,并在 E.coli .BL21中得到G FP 基因的高效表达。

方法:PCR 法从pEG FP 质粒克隆G FP -S65T cDNA 并在5’末端引入K pn I 的位点。

将扩增出来的G FP -S65T 基因和pRSET -B 质粒用Hind III 和K pn I 双酶切后连接构成重组质粒。

用化学法把重组质粒转化到 E.coli .BL21中,培养发酵液OD 540=0.4时加入IPTG 诱导G FP -S65T 基因转录和表达,合成绿色荧光蛋白。

还对诱导条件进行了优化,发酵液OD 540=0.4加入IPTG 可以得到最优表达。

结果:通过Ni 2+柱亲和层析,纯化得到绿色荧光蛋白,S DS -PAGE 电泳检测,分子量为27kDa ,与文献报道值一致。

这说明Ni 2+柱能够有效的纯化表达产物。

结论:成功构建了新型瞬时表达载体pRSET -EG FP ,并且在 E.coli .BL21中得到高效表达。

关键词:绿色荧光蛋白;G FP -S65T;基因表达;新型载体中图分类号:Q782 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2004)06-0001-03Construction of N ovelty Plastid Transient Expression V ector pRSET -GFPand its ExpressionLU Jia -hui ,ME NG Qing -fan ,G AO Chao -hui ,W ANG Y an -ping ,W ANG X iao -nan ,X U Y an ,MA Y ue -jia ,Y ANG Y i -dai ,TE NGLi -rong(C ollege of Life Science ,JilinUniversity ,Changchun 130012,P 1R 1China )Abstract :Objective :Using m olecular biology method and techniques ,the plasmid pRSET -B was constructed to a novelty transient expressionvector pRSET -EG FP carrying the mutant gene of green fluorescent protein (G FP -S65T ),and it was expressed in E.coli BL21.Methods :G FP -S65T cDNA was cloned from plasmid pEG FP with K pn I site attached at the 5’termination of cDNA fragment by PCR.The PCR product of G FP -S65T gene and the plasmid pRSET -B were digested with Hind III and K pn I ,and then ligated as a novelty plasmid.The recombinant plasmid was trans formed into E.coli .BL21by the chemical method.Added IPTG to induce the G FP -S65T transcription and expression ,synthesize the green fluorescent protein.The optimum condition of expression was optimized ,when the OD 540of the culture was 0.4,the expression was the maxi 2mum.R esults :The protein was purified by the affinity chromatography on a Ni 2+column ,and the expression products were identified by S DS -PAGE gel electrophoresis.The m olecular weight of the protein is about 27kD ,was in accord with the referrence ,which indicates that the Ni 2+col 2umn could purify the product efficiently.Conclusion :A novelty transient expression vector pRSET -EG FP was constructed success fully and ex 2pressed effectively in E.coli .BL21.K ey w ords :G reen fluorescent protein ;G FP -S65T;gene expression ;novelty vector 收稿日期:2004-07-25;修回日期:2004-10-14基金项目:全国教育科学“十五”规划课题(DIAO30165)作者简介:逯家辉(1965-),男,工程师,从事工程菌构建的研究,E -mail :lujiahui1965@ ;3联系人:滕利荣(1954-),男,教授,从事工程菌应用研究,E -mail :tenglirong @ 。

烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究

烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究

烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇;朱鸿亮【期刊名称】《植物学研究》【年(卷),期】2015(004)002【摘要】本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染,探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响,建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。

结果表明,β-葡萄糖苷酶(GUS β-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。

农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效,结果准确可靠,从种子播种到收获蛋白只需25天左右。

该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。

【总页数】7页(P25-31)【作者】文莉薇;朱鸿亮【作者单位】[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京;;[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 [J], 常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉3.烟草基因组计划进展篇：6.烟草全基因组过量表达和RNA干涉体系的建立与应用 [J], 路铁刚4.棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 [J], 李妮娜;丁林云;张志远;郭旺珍5.杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶基因DsLYCE表达载体构建及其在烟草中瞬时表达分析 [J], 王计平; 安茜; 段露露; 赵熙宁; 岳敏; 崔红利; 李润植因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体

利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体

利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)是利用DNA重组技术和蛋白质工程技术合成的一种小分子基因工程抗体,最近在肿瘤的诊断和治疗上得到广泛应用。

本研究利用改造的植物病毒载体在烟草(Nicotiana benthamiana)和豌豆(Pisum sativum L.)中瞬时表达抗人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,a FGF)的单链抗体,旨在建立一种安全、高效,易于规模化生产的单链抗体瞬时表达体系。

本研究首先利用基于烟草花叶病毒(TMV)的p35S-30B表达载体,建立烟草瞬时表达体系并表达抗a FGF单链抗体,验证sc Fv在植物中表达的可行性;接着利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的p CAPE1和p CAPE2-GFP载体建立豌豆瞬时表达体系,通过叶片注射法在豌豆中瞬时表达sc Fv,寻找更适于sc Fv表达的受体植物;最后建立一种基于豌豆芽苗菜无土栽培的规模化植物瞬时表达系统,并对该系统表达的sc Fv进行纯化及生物学活性分析。

本研究的主要结论:(1)利用p35S-30B-GFP载体建立了基于叶片注射法的烟草瞬时表达体系,绿色荧光蛋白(GFP)在病毒侵染后8-10天达到峰值;利用含p35S-30B-sc Fv重组质粒的农杆菌EHA105侵染烟草,瞬时表达的sc Fv具有较强的抗原结合能力。

(2)利用p CAPE1和p CAPE2-GFP载体通过叶片注射法建立了豌豆瞬时表达体系,病毒侵染后的10-12天GFP达到最大量累积;成功构建了p CAPE2-sc Fv 和p CAPE2-GFP-sc Fv瞬时表达载体,利用叶片注射法侵染豌豆后,分别在RNA 和蛋白水平上检测到sc Fv基因的表达,ELISA检测证明sc Fv和GFP-sc Fv与抗原具有较好的结合能力。

烟草瞬时表达步骤 电子版

烟草瞬时表达步骤 电子版

亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。

3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。

6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。

7.观察。

GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。

4、0.2M Na2CO3 buffer。

Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。