6-5 细菌转化

细菌转化的步骤细菌转化技术是一种在细菌体内将外源基因(新的基因)引入，从而使细菌表达新的生物酶或代谢产物的过程。

该技术不仅可以为合成生物学和微生物发酵技术提供新的功能，而且可以用于提高抗药性、去除污染物和制备新药物等方面的应用。

细菌转化过程大致可分为三个步骤：基因构建、转化及检测。

首先，基因构建是将外源基因插入到适当的载体中，以便将它们引入到细菌中。

在这一步骤中，必须提前准备好新基因，并将其与在载体中已有的基因结合起来，以便将其传递到细菌中。

这一步骤可以使用多种技术，如PCR 法、DNA合成法、DNA克隆法等。

其次，转化是将构建的基因插入到细菌体内的过程。

一般采用磁珠法将基因构建的载体与细菌混合，然后电离辐射或其他方法将基因转移到细菌体内。

最后，检测是检查转化成功的最后一步。

一般会采用PCR法、Southern Blotting法、Western Blotting法等技术，以检查细菌中是否有目标基因的表达。

如果检测结果显示目标基因的表达，则说明细菌转化成功，可以进一步研究新基因的功能和作用。

由此可见，细菌转化的整个过程包括基因构建、转化及检测三个步骤。

首先，要准备好新基因，并将其与在载体中已有的基因结合起来，以便将其传递到细菌中;其次，用磁珠法将基因构建的载体与细菌混合，然后电离辐射或其他方法将基因转移到细菌体内;最后，用PCR法、Southern Blotting法、Western Blotting法等技术检查细菌中是否有目标基因的表达。

如果检测结果显示目标基因的表达，则说明细菌转化成功，可以进一步研究新基因的功能和作用。

在实际中，细菌转化技术的应用非常广泛，如转化细菌可用于抗药性研究、环境污染物去除、生物燃料发酵、生物质转化、生物变态物质制备、药物分子设计和制备等。

因此，细菌转化技术应用在生命科学领域中有着重要的意义。

细菌转化技术的优点也十分明显，它可以更快地引入新基因，比传统的遗传转化技术更有效，并且具有较高的效率，可以大大提高细菌的生产能力和表达能力。

细菌转化（bacterial transformation）原理和操作1．目的学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

2．原理质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。

然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

4．试剂LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X- gal。

5．实验准备无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

6．操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。

（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60 min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

格里菲斯实验释疑：细菌如何转化1 细菌转化需处于感受态R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。

此时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。

感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。

2 转化因子的吸收被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。

当“转化因子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌染色体组（可理解为DNA，后同）上的同源区段配对，并使受体染色体组的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态），由此可见，细菌转化的实质是基因重组。

3 转化纯合子通过复制和分裂产生随着受体菌染色体组进行复制，杂合区段（如MN，N为转化因子）复制后的基因型为MM和NN分离成两个，其中之一类似供体菌NN，另一类似受体菌MM。

当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。

4 细菌转化的机理4.1通过分裂实现“真”转化因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种纯种后代，并不是多数人认为转化是R型细菌吸收转化因子直接变成S型。

4.2 依赖感受态无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。

反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。

2015.11.01细菌转化：
1.将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上
2.在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20-30微升中（不要用手捂菌，手也不要碰到EP管盖）
3.冰上30min，每隔5min轻摇EP管
4.将混合液在42℃中热激90s，将质粒粘附在感受态细胞表面，立即冰上静置1min
5.加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37℃振荡1-2h(45min)，使菌恢复正常
6.涂板，倒扣平板12-24h
7.挑取单克隆，扩大培养（培养基中加入相应抗生素，每100ml培养基加100微升抗生素）37℃摇菌（不超过16h）
8.提质粒
Attention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却一下！！！！！
涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆
扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下
在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分钟，然后再倒扣起码14h 让菌张起来。

这个过程中不要开摇晃，直接37℃放置就好。

e6-5 细菌转化实验和噬菌体实验1928年，Frederick Griffith的肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）转化（transformation）实验是DNA作为遗传物质的第一个有利证据。

他所使用的肺炎双球菌有两种，一种为光滑型（smooth，S），其细胞壁的外面有一个多糖荚膜（capsule），另一种为没有荚膜的粗糙型（rough，R）。

S型双球菌感染小鼠会导致小鼠患败血症而死亡，但将S型双球菌加热杀死后再感染小鼠则不会致病。

R型肺炎双球菌感染小鼠不会引起小鼠的死亡，但如果将R型细菌和加热杀“死”的S型细菌混合后感染小鼠能导致小鼠死亡，并在其体内检出活的S 型细菌[图e6-5(1)]。

Griffith认为，实验的结果是由于加热杀死的S细菌含有某种“转化因子”，可导致活的R细菌发生转化作用，从而使R型细菌恢复了生成荚膜的能力。

三年后发现，只需有加热杀死的S细菌的存在，就可导致R型双球菌在体外发生转化。

又过了两年，进一步证明只要将S细菌的提取液加到生长着R型细菌的培养基中，同样也能发生转化。

那么提取物中究竟是哪一种物质充当“转化因子”促使S细菌发生转化的呢？Griffith 最初认为，接种物中的死细菌可能提供了某些特异性的蛋白质为食料，使R型细菌能制造出荚膜。

图e6-5(1) Frederick Griffith的肺炎双球菌转化实验随后，O.T. Avery、C.M. Macleod 和M. Mccarty在前人工作的基础上，经过近十年的努力，终于成功在体外完成了转化实验[图e6-5(2)]，并确定了这种转化因子的化学本质是DNA，而不是蛋白质或其他的大分子。

他们将S型细菌加热杀死后，分离出多糖、脂类、RNA、蛋白质和DNA，然后分别加到R型细菌中培养，仅在加入S 型DNA的R型细菌中发生转化，产生了R型细菌和S型细菌。

同时他们还用不同的水解酶来处理各提取物，观察对实验的影响，结果发现在DNA中加入一种使DNA降解的DNA酶后就不能发生转化了。

细菌的转化【实验原理】（一）DNA的转化转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。

细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态。

用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。

重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细胞进入一个敏感的感受状态，以便外源DNA进入细菌内。

感受态的制备方法很多，如CaCl2法、Hanahan法、超级感受态法和电转化法，相比之下，CaCl2法操作简便，重现性好，转化率一般能达到5×106-2×107转化子/µg 质粒DNA，可以满足大多数的实验要求，为人们广泛接受，很多尖端实验室仍然在使用。

这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被λ噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌，其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA粘附于细胞表现，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

（二）重组子的鉴定重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，lacZ’基因编码的α肽链β-半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸），宿主编码的 片段（缺失N端的β-半乳糖苷酶）和质粒编码的α片段各自都不具有β-半乳糖苷酶活性，但它们要以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。

LacZ基因编码的α肽链与失去N 端的β-半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。

由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的产物5-溴-4-靛蓝。

细菌转化实验原理与操作步骤转化(tｒａnsｆｏrmatｉoｎ)就是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,就是现代分子生物学研究与基因工程不可缺少的重要技术。

关键词:细菌转化细菌转化一、实验目的1.以pGLO 质粒转化大肠杆菌为例,学习转化的基本原理及方法。

2 、验证DNA 就是遗传物质,加深对中心法则的理解。

二、实验原理转化( ｔransformatioｎ)就是指一段同源或异源的ＤNＡ转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,就是现代分子生物学研究与基因工程不可缺少的重要技术。

目前常用的转化方法有CaCl 2 法( 化学转化法)与电转化法。

本实验就是用pGＬO 细菌转化试剂盒中提供的pGＬO 质粒来转化大肠杆菌,所用方法为CaCl 2 转化法。

pGLＯ质粒:pＧLO 质粒上主要含有两个基因,一个为编码绿色荧光蛋白(GFP) 的基因,一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。

此外,该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系,转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。

转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光,这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

ﻫ三. 实验材料受体菌: E.coｌi K12 HB101质粒: pGLO pｌaｓmid转化液( ＣaCl2 )氨苄青霉素( aｍp )阿拉伯糖( ara )培养基:固体LＢ、液体ＬB接种环、移液器等四. 实验步骤１. 准备平板: 每组: 1块ＬB 平板, 2 块ＬB/aｍp 平板, 1 块LB/amp/ａｒa 平板2. 准备感受态细胞:用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉,此即感受态细胞。

3、活化受体细胞:挑取1 环E.colｉK12ＨB101 菌液,于LB 培养基上３７℃活化16－24ｈ。

１) 在两只无菌离心管上分别标记＋DＮA,-ＤNA 。

细菌转化实验原理和操作步骤转化（transformation ）是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。

关键词：细菌转化细菌转化一．实验目的1 ．以pGLO 质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。

2 ．验证DNA 是遗传物质，加深对中心法则的理解。

二．实验原理转化（transformation ）是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。

目前常用的转化方法有CaCl 2 法( 化学转化法) 和电转化法。

本实验是用pGLO 细菌转化试剂盒中提供的pGLO 质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl 2 转化法。

pGLO 质粒：pGLO 质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP) 的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。

此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。

转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

三．实验材料受体菌：E.coli K12 HB101质粒：pGLO plasmid转化液（CaCl2 ）氨苄青霉素（amp ）阿拉伯糖（ara ）培养基：固体LB 、液体LB接种环、移液器等四．实验步骤1. 准备平板：每组：1 块LB 平板，2 块LB/amp 平板，1 块LB/amp/ara 平板2. 准备感受态细胞：用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。

3. 活化受体细胞：挑取1 环E.coli K12 HB101 菌液，于LB 培养基上37 ℃活化16-24h 。

1）在两只无菌离心管上分别标记+DNA, -DNA 。