第三章病毒习题及答案
一、名词解释
1.包涵体：当病毒颗粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，形成了具有一定形态、构造并能用光镜观察的特殊群体，称为包涵体。
2.噬菌斑：将噬菌体与敏感宿主菌在固体培养基上培养一段时间后宿主细菌菌苔上出现的一个个透明圈或负菌落，称为噬菌斑。
3.烈性噬菌体：短时间内能在宿主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体，并通过裂解寄主细胞而释放出来的噬菌体，被称为烈性噬菌体。
4.温和噬菌体：某些噬菌体侵染细菌后，将自身核基因组整合到宿主细胞核染色体上，随宿主细胞核基因组的复制而进行同步复制，并不引起寄主细菌裂解，称作温和噬菌体。
5.一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。
6.溶源性：温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，与宿主菌共存的特性称为溶源性或溶源现象。
7.溶源菌：是指在核基因组上整合有前噬菌体，能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。
8.病毒多角体：多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称为多角体。
9.类病毒：是由单链共价闭合环状RNA分子组成，专性寄生在活细胞内的分子病原体。
10.拟病毒：是一类包裹于真病毒粒中的有缺陷的类病毒。
11.朊病毒：朊病毒是一类不含核酸的传染性蛋白质分子。
二、包涵体和噬菌斑各有何实践意义？
答：1、包涵体是病毒颗粒的群体形态，有助于对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等许多实际工作。由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。
2、噬菌斑有一定的形态，可用作该噬菌体的鉴定指标，也用于纯种分离纯化和计数。
三、简述测定噬菌体效价的双层平板法。
答：预先分别配制含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温。一般经10余h后即可对噬菌斑计数。
这种方法有许多优点，可弥补培养皿底部不平的缺陷，使噬菌斑大小一致、边缘
清晰且无重叠现象，并可形成形态较大、特征较明显以及便于观察和计数的噬菌斑。
四、简述烈性噬菌体的裂解性生活周期。
答：（1）吸附：噬菌体尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体接触，尾丝散开并附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细胞表面。
（2）侵入：吸附后尾丝收缩，把尾管堆出并插入细胞壁和膜中，头部的核酸迅速通过尾管及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋白质躯壳留在壁外。
（3）增殖：利用宿主细胞的代谢系统进行噬菌体核酸的复制和蛋白质生物合成。产生一大群形状、大小完全相同的子代噬菌体。
（4）成熟（装配）：把已合成的各种部件装配组合起来，包括DNA分子的缩合，通过衣壳包裹DNA而形成完整的头部，尾丝和尾部的其他“部件”独立装配完成，头部和尾部相结合后，最后再装上尾丝。
（5）裂解（释放）：宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶等作用，促进细胞的裂解，从而完成了子代噬菌体的释放。
五、现怀疑一发酵罐液体受噬菌体污染
答：（一）如受溶源菌温和噬菌体污染，检测其溶源菌方法为：
1．将少量待测菌与大量敏感性指示菌（溶源菌裂解后释放出的温和噬菌体可使之发生裂解性周期）混合，涂布于琼脂平板上。
2．培养一段时间后，溶源菌可长出菌落。
3．由于溶源菌在生长过程中有极少数个体会发生自发裂解，产生的噬菌体可侵染溶源菌周围敏感性指示菌菌苔，这样会产生一个个中央为溶源菌小菌落，周围有透明圈的特殊噬菌斑。
（二）如为烈性噬菌体污染，其检测方法为双层平板法：
预先分别配制含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温。一般经10余h后即可对噬菌斑计数。
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
转思路迪博客：慢病毒载体发展 和“简单型”逆转录病毒载体的设计类似，对慢病毒载体的改造也是基于将其病毒基因组分成三个载体分别表达 包膜蛋白，病毒包装蛋白和外源表达载体。当使用慢病毒载体用于临床基因治疗时，有些系统甚至使用4或者5质粒系统以降低产生复制性病毒(RCR, replicative-competent retrovirus)的可能性从而增加体内使用的安全性。与“简单型”逆转录病毒不同的是，慢病毒由于存在辅助蛋白和调控蛋白，其载体改造涉及更多的对这些反式作用因子的去除以及相应的顺式作用元件的改造。第一代慢病毒载体使用三质粒系统，将包膜蛋白单独置于一个质粒中表达，包装载体含有除包膜蛋白编码基因的全病毒基因组，使用CMV启动基因表达，并用人胰岛素基因的polyA替代3’LTR作为加尾信号，同时将外源插入片段以及所有相关顺式作用元件(包装信号y，LTRs，RRE和引发结合位点(PBS, primer binding site))置于外源表达载体中。第二代慢病毒载体去除了辅助蛋白编码基因Vif，Vpr，Vpu和Nef，以减少产生RCR的风险。第三代慢病毒载体则去除了对Tat和Rev蛋白因子的依赖作用。通过将5’LTR中的U3区替换成CMV，可以消除对Tat的依赖；通过对gag-pol编码基因的密码子进行优化，可以解除对Rev的依赖。许多顺式作用元件(DNA序列)对病毒的包
装效率影响也很大，比如cPPT和来源于Igk的MAR (matrix attachment region)，以及WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)，其可以有效帮助mRNA的polyA加尾效率。同时通过失活3’LTR区的U3区，可以减少病毒载体整合后对宿主整合位点附近基因的表达干扰，而且还可以有助于引入诱导表达或者组织特异性表达系统。包膜蛋白表达载体：慢病毒载体改造中一个重大突破是将慢病毒自身的包膜蛋白 替换成其它病毒的包膜蛋白，尤其是VSV-G。VSV-G包膜蛋白赋予慢病毒载体三个非常重要的特性：1)，稳定慢病毒载体颗粒，使得其可以承受超离心的剪切力，因此可以进行浓缩，从而可以获得超高滴度(1011IU/ml)以用于体内实验(动物实验和基因治疗)；2)，其受体为细胞膜上的磷脂酰丝氨酸分子，因此极大拓展慢病毒载体的侵染谱系；3)，介导慢病毒载体进入胞吞途径，从而使得整个侵染整合过程减少了对慢病毒自身辅助蛋白的依赖。当然，VSV-G蛋白也有一些缺点：1)，用于动物体内实验时，有报道出现针对VSV-G蛋白的补体和抗体介导的免疫反应从而阻碍慢病毒载体的功能 发挥；2)，体内少数组织，比如气管上皮细胞的顶端面缺乏VSV-G受体，因此携有VSV-G的慢病毒载体在体内对其侵染性极低。通过使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解决这个问题，从而使得囊性纤维化疾病的基因治疗(其主要靶底是气管组织)成为可能。因此，显然为了进一步拓展慢病毒载体的侵
EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表 达载体的构建 【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。 【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
第三章病毒习题及答案 一、名词解释 1.包涵体：当病毒颗粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，形成了具有一定形态、构造并能用光镜观察的特殊群体，称为包涵体。 2.噬菌斑：将噬菌体与敏感宿主菌在固体培养基上培养一段时间后宿主细菌菌苔上出现的一个个透明圈或负菌落，称为噬菌斑。 3.烈性噬菌体：短时间内能在宿主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体，并通过裂解寄主细胞而释放出来的噬菌体，被称为烈性噬菌体。 4.温和噬菌体：某些噬菌体侵染细菌后，将自身核基因组整合到宿主细胞核染色体上，随宿主细胞核基因组的复制而进行同步复制，并不引起寄主细菌裂解，称作温和噬菌体。 5.一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 6.溶源性：温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，与宿主菌共存的特性称为溶源性或溶源现象。 7.溶源菌：是指在核基因组上整合有前噬菌体，能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。 8.病毒多角体：多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称为多角体。 9.类病毒：是由单链共价闭合环状RNA分子组成，专性寄生在活细胞内的分子病原体。 10.拟病毒：是一类包裹于真病毒粒中的有缺陷的类病毒。 11.朊病毒：朊病毒是一类不含核酸的传染性蛋白质分子。 二、包涵体和噬菌斑各有何实践意义？ 答：1、包涵体是病毒颗粒的群体形态，有助于对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等许多实际工作。由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。 2、噬菌斑有一定的形态，可用作该噬菌体的鉴定指标，也用于纯种分离纯化和计数。 三、简述测定噬菌体效价的双层平板法。 答：预先分别配制含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温。一般经10余h后即可对噬菌斑计数。 这种方法有许多优点，可弥补培养皿底部不平的缺陷，使噬菌斑大小一致、边缘
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；
第三章病毒习题 填空题： 1．病毒的存在范围是病毒能够感染并在其中复制的___宿主种类和组织细胞种类___。 2．从原核生物中分离的病毒统称噬菌体，它们包括___噬菌体___、___噬蓝(绿)藻体___和___支原体噬菌体___等。 3．病毒属名的词尾是___virus___、科名的词尾是___viridae___、亚科名的词尾是___virinae___，目名的词尾是___virales___。 4．纯化的病毒制备物应保持其___感染性___和___理化性质的均一性___。 5．血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制___病毒的血细胞凝集___性质设计的。 6．螺旋对称病毒体的直径是由___蛋白质亚基的大小___决定的，而其长度则是由___病毒核酸分子的长度___所决定的。 7．病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为___结构蛋白___和___非结构蛋白___两类。 8．病毒包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过___β-N-糖苷键___将糖链的___N-乙酰葡萄糖胺___与肽链的___天冬酰胺残基___—连接形成。 9．由一步生长曲线可获得病毒繁殖的两个特征性数据，即潜伏期和裂解量。前者为___病毒吸附于细胞到子代病毒释放___所需的最短的时间，后者为___每个受染细胞释放的子代病毒___的平均数目。 10．病毒的复制过程依其发生事件顺序分为以下___吸附___、___侵入___、___脱壳___、___病毒大分子合成___和___装配与释放___5个阶段。 11．动物病毒进入细胞的方式包括___移位___、___内吞___、___病毒包膜与细胞质膜融合___、___依赖抗体的增强作用___等。 12．动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括___5’末端加帽___、___3’末端聚腺苷化___、___甲基化___和___拼接___等修饰才能成熟为功能性mRNA。 13．病毒的非增殖性感染有___流产感染___、___限制性感染___和___潜伏感染___3种类型。 14．流产感染的发生或是由于病毒感染的细胞是___非允许细胞___或是由于感染的病毒是___缺损病毒___。 15．有生物活性的缺损病毒包括___干扰缺损病毒___、___卫星病毒___、___条件缺损病毒___和___整合的病毒基因组___4类。 16．溶源性转变是指原噬菌体所引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表型的改变，包括___细胞表面性质的改变___和___致病性转变___。 17．根据病毒感染机体所引起症状的明显程度，可分为___显性感染___和___隐性感染___o 18．毒力是特定的病毒___致病性的强弱___，它是___病毒株___的特征。 19．亚病毒包括___类病毒___、___卫星病毒___、___卫星RNA ___和___朊病毒___。 20．动物病毒感染抑制宿主细胞DNA复制的原因是___为病毒DNA合成提供前体___、___为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和／或复制蛋白___和___细胞蛋白质合成被抑制的次级效应___。 选择题（4个答案选一）： 1．病毒显著区别于其他生物的特征是( (2) )。 (1)具有感染性 (2)独特的繁殖方式 (3)体积微小 (4)细胞内寄生 2．病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的，包括( (2) )。 (1)病毒的核酸是DNA或是RNA (2)病毒的主要化学组成是蛋白质 (3)病毒含有脂类和糖类 (4)病毒体积微小 3．病毒物理颗粒计数方法测定的是( (3) )。 (1)有活力的病毒数量 (2)无活力的病毒数量 (3)有活力的病毒与无活力病毒数量的总和 (4)致病性的病毒数量 4．描述螺旋对称壳体特征的参数有( (2) )。 (1)核酸的相对分子质量 (2)螺旋长度与直径 (3)螺旋的外观 (4)蛋白质亚基大小 5．ssRNA能够按照它的极性或意义分为( (2) )。 (1)感染性核酸和非感性核酸 (2)正链RNA、负链RNA和双意RNA (3)反意RNA和正意RNA (4)基因组RNA 和非基因组RNA 6．以下病毒中在细胞核内复制的有( (1) )。 (1)腺病毒 (2)痘病毒 (3)小RNA病毒 (4)嗜肝DNA病毒 7．T4噬菌体的的装配包括的亚装配过程有( (3) )。 (1)2个 (2)3个 (3)4个 (4)5个 8．构成机体病毒感染的因素包括( (2) )。
高中生物病毒有关知识点归纳 病毒是一类非细胞结构的生物。由于它的结构与高等动植物及其他生物完全不同，所以生物学家在分类时将它作为特殊的一类，单独列为病毒界。在高中生物学以及高考中也经常涉及有关病毒的知识点及考点。 一、大小 发现史：19世纪,伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想这种病是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用能将细菌滤去的过滤器进行过滤，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。 发现问题： 提出假说： 设计实验：（加法、减法） 得出结论：这表明烟草花叶病是由比细菌还小的病原体引起的，他把这种病原体叫做"滤过性病毒"。 病毒形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察到，一般可以通过细菌滤器(一般的直径为1-10μm，而多数病毒的直径在100 nm左右)。 二、成分和结构 1、成分 病毒没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心或基因组，蛋白质包围在核心周围，构成病毒粒子的衣壳。衣壳对核酸有保护作用，是病毒粒子的抗原成分。它们共同称为核衣壳，是任何病毒(指“真病毒”)所必需的基本结构。有些较复杂的病毒，在其核衣壳外还有一层囊膜包被。 2、结构 衣壳：蛋白质 髓部：DNA或RNA 特殊包膜 刺突 每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA，这也是病毒分类的依据之一。如DNA病毒有：噬菌体、疱疹病毒、各种腺病毒等。RNA病毒有：艾滋病毒、烟草花叶病毒、车前草病毒等。 三、生活方式 1、生活方式 病毒在宿主的活细胞内寄生生活。离开宿主细胞，病毒能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶 不同的病毒只能寄生在特定的宿主细胞内，具有专一性，这也是病毒分类的另一个重要依据。如专门寄生在动物细胞中的称为动物病毒(艾滋病毒等)，专门寄生在植物细胞中的称为植物病毒(烟草花叶病毒等)，专门寄生在细菌细胞中的称为细菌病毒(噬菌体)。 噬菌体的繁殖一般可分为五个阶段：即吸附一侵入→增殖(复制与生物合成)→成熟(装配)→裂解(释放)。整个过程必须在它的宿主活细胞中完成。 只有核酸进入宿主细胞，换言之，只提供了复制和表达的模板，其他的原料、能量、酶、
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
第三章病毒和亚病毒 一、名词解释 噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。 噬菌体：原核生物的病毒。 病毒：是微生物中最小的生命实体，组成简单，由核酸（DNA或RNA）和一种或少数多种蛋白质组成的非细胞生物。 是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非 细胞生物。 溶源细胞：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动。 温和噬菌体：能导致溶源性发生的噬菌体。 烈性噬菌体：噬菌体在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖（复制与生物合成）→成熟（装配）→裂解（释放）五个阶段而实现其繁殖的噬菌 体，称为烈性噬菌体。 原噬菌体：某些温和噬菌体侵染细菌后，其核酸整合到宿主细菌染色体中。 处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体。 类病毒：是一类只含RNA一种成分、专性寄生在活体的分子病原体。 一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 逆转录病毒：能编码逆转录酶的RNA病毒。病毒RNA基因组可逆转录为病毒DNA，并整合在宿主染色体中一同复制。 裂解量：平均每个宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数。 双层平板法：先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计 算噬菌斑的数量。 效价：每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。 壳体：包在髓核外面的一层蛋白质膜。
阮病毒：不含核酸的传染性蛋白分子，能引起宿主体内的同类蛋白分子发生与其形似的构象变化，而使寄主致病。 壳粒：组成壳体的形态结构单位。 核壳：病毒核酸加上包围的蛋白质衣壳。 包膜：大多数动物病毒，核衣壳外由蛋白或糖蛋白与脂肪所形成类脂（来自寄主）双层外膜，称为包膜。 刺突：糖蛋白在膜上形成各种形状的突起，称刺突。 潜伏期：指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子释放前的一段时间。 卫星病毒：是一类存在于某专一病毒粒（辅助病毒）的衣壳内，并完全依赖后者才能复制自己的小分子RNA病毒。 溶源性：当温和噬菌体侵入宿主细胞后，DNA整合到宿主基因组上，随着宿主DNA 复制而复制，但不合成蛋白质，宿主细胞不裂解，继续进行正常 的分裂现象。 自发裂解：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动，进行大量的复制成为营养噬菌体核酸，并接着成 熟为噬菌体粒子，引起宿主细胞裂解。 溶源转变：当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状 的现象，称为溶源转变。 包涵体：表达外源基因的宿主细胞。 二、填空题 1.病毒分为真病毒（简称病毒）和亚病毒分子，后者又分为类病毒、拟 病毒、卫星病毒、卫星RNA 和朊病毒。 2.病毒直径很小，通常用nm 作为度量单位，最大的病毒为似菌病毒和一 种海洋原生病毒，最小的病毒为猪圆环病毒（PCV）和长尾鹦鹉喙羽病 毒（PBFDV），病毒、细菌和真菌个体直径比约1：10：100 。
腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则5 4.2.2 共转化方法5 4.2.3 预期结果5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常用技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14
5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表达26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.doczj.com/doc/1314342733.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/1314342733.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.doczj.com/doc/1314342733.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/1314342733.html,/
第三章病毒和亚病毒 一．选择题 1.病毒的大小以 ( ) 为单位量度。 a) A m b)nm c)mm d)答:( ) 2.类病毒是一类仅含有侵染性的病毒。 A.蛋白质 B.RNA C.DNA D.DNA 和 RNA。 3.病毒壳体的组成成份是： A.核酸 B.蛋白质 C.多糖 D.脂类 4.病毒囊膜的组成成分是： A.脂类 B.多糖 C.蛋白质 5.病毒含有的核酸通常是： A.DNA 和 RNA B.DNA 或 RNA C.DNA D.RNA 6.最先发现病毒的是： A.巴斯德 B.柯赫 C.伊万诺夫斯基 D.吕文虎克 7.NPV 是 A.核多角体病毒 B.质多角体病毒 C.颗粒体病毒 8.GV 是： A.无包涵体病毒 B.颗粒体病毒 C.核多角体病毒 9.噬菌体是专性寄生于的寄生物。 A.细菌 B.酵母菌 C.霉菌 10.病毒的分类目前以为主 A.寄主 B.形态 C.核酸 11.在溶源细胞中 , 原噬菌体以状态存在于宿主细胞中， A.游离于细胞质中 B.缺陷噬菌体
C.插入寄主染色体 12.溶原性细菌对具有免疫性 : A.所有噬菌体 B.部分噬菌体 C.外来同源噬菌体 D.其它噬菌体 二．判断题 1.原噬菌体即插入寄主染色体 DNA 上的噬菌体 DNA。 答：( ) 2.溶源性细菌在一定条件诱发下 , 可变为烈性噬菌体裂解寄 主细胞。 答:( ) 3.T4噬菌体粒子的形态为杆状。 答:( ) 4.DNA 病毒以双链为多 , 而 RNA 病毒以单链为多 答:( ) 5.植物病毒的核酸主要是 DNA, 而细菌病毒的核酸主要是 RNA。 答:( ) 6.大肠杆菌噬菌体靠尾部的溶菌酶溶解寄主细胞壁后靠尾 鞘收缩将 DNA 注入寄主细胞。 答:( ) 7.一种细菌只能被一种噬菌体感染 . 答:( ) 8.温和噬菌体的毒性突变体与寄主细胞的关系和一般的毒 性噬菌体一样。 答:( ) 9.各种噬菌体裂解寄主细胞时释放出约 1 个病毒粒子 . 答:( ) 10. (+)DNA 即是与 mRNA 序列互补的 DNA. 答:( ) 11.逆转录病毒 RNA 可以反转录为 DNA. 答:( ) 12.朊病毒 ( 奇异病毒 ) 是只含有侵染性蛋白质的病毒 . 答:( ) 三．填空题 1.毒性噬菌体入侵寄主的过程可分为_______、__________、__________、__________、 __________ 等五个阶段。. 2.TMV 病毒粒子的形状为____________, 所含核酸为_______________。 3.T4噬菌体感染寄主细胞依靠______________ 将____________ 注入寄主 细胞。 4.检查细菌是否被噬菌体感染的方法，通常是______________________________、 ________________________________________ 。 5.病毒的蛋白质除了构成壳体以外，还与病毒的__________ 有关， 有些则是一些酶，如___________, 与溶解细菌细胞壁有关。 6.一种病毒只含一种核酸 , 即 __________ 或 __________；植物病毒多 为 __________病毒 ; 噬菌体多为 __________病毒。 7.病毒是一种无 _________ 结构 , 能通过 ________ , 严格寄生于 __________ 的超显微生物。 8.类病毒是美国的 __________ 在研究 __________ 时发现的 . 9.病毒的核壳体结构是: 外壳是 __________, 壳体内是 _________ , 二者共同构成