荧光免疫标记技术37页PPT

可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：

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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
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竞争法
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• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
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– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
免疫荧光技术的基本原理
样品制备
免疫荧光染色
结果观察
免疫荧光技术的操作步骤
优点
特异性高、灵敏度高、定位准确、能够同时检测多个抗原、适用于各种组织和细胞样品等。
定义
免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理
免疫荧光技术的定义和原理
1
免疫荧光技术的应用范围
2
3
免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
xx年xx月xx日
CATALOGUE
目录
免疫荧光技术概述免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的临床应用免疫荧光技术的质量控制和标准化总结与展望
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
疾病诊断
疫苗研发
细胞功能研究
药物疗效监测
通过免疫荧光技术了解免疫应答机制，为疫苗研发提供帮助。
利用免疫荧光技术对细胞表面分子的检测，有助于细胞功能研究。
免疫荧光技术可用于监测治疗后的血清抗体水平，评估药物疗效。
05
总结与展望
诊断感染性疾病
免疫荧光技术可以快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物感染，有助于早期诊断和治疗。

透析法：
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
【主要试剂与器材】 1．器材 （1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、
紫外分光光度计 （2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸 2．试剂 （1）抗体 （2）异硫氰基荧光黄（FITC） （3）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） （4）pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液 （5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理 以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应 的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗 体结合部位，检测出抗原或抗体。
荧光免疫标记技术
免疫标记（immunolabelling technic）
是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射 性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为 追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。
通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性 质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微 镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化 测定。
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微 示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。

详细描述
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声

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ELISA基本的实验过程
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【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
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【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
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【实验原理】
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【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
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【实验结果】
阳 阴 无性效：
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思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
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简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
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放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
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免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)

• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经 标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
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第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
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• (E)
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6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
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7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
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标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
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二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
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试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
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返回
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荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)