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（生物科技行业）微生物真题分章节厦门大学微生物考研真题绪论微生物分类及常见代表微生物？（98、99）从微生物代谢特点来解释微生物“分布广，种类多，数量大”的原因？（99）第一章原核生物形态，构造和功能细菌和酵母菌的生态分布？（99）1.细胞壁构造5.磷壁酸（04）3..肽聚糖单体（06）外膜（08）举例说明肽桥的类型？（01）分别写出细菌放线菌霉菌酵母菌细胞壁的主要成分？（01）1.比较革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁成分及结构的异同点.(4分)（04）比较G+和G-菌细胞对机械抗性、溶菌酶、碱性染料敏感性的差异且解释其可能机制？（08）8．试述内毒素生产菌的细胞结构和组成，且简要说明内毒素的免疫特性及其主要检测方法。
（8分）（07）8．真细菌肽聚糖和古细菌假肽聚糖的组成和结构有何不同6分（06）1．革兰氏染色关键的步骤是哪壹步，为什么？6分（06）抗酸染色（08）LPS的毒性成分是（）。
类脂A核心多糖O-侧链脂蛋白（08）2.缺壁细胞2．支原体（3分）（03）12、L型细菌（05）5．在细菌中，专性能量寄生的为：支原体衣原体立克次氏体MLO（06）2、何谓缺壁细菌？说明4种缺壁细菌形成原因及特点。
（5分）（07）3.特殊细胞构造和细胞内含物荚膜的化学成分、功能？（98）菌胶团（2001）1．龋齿的形成和某些产荚膜细菌有关吗？解释你的答案。
（02）内生孢子（98）2、芽孢子（05）1.芽孢囊（06）半孢晶体（08）1．试根据“渗透调节皮层膨胀学说”分析芽孢的抗热机制。
（5分）（03）菌毛形态和种类？（01）9、细菌的菌毛的主要功能是：A、运动B、传递遗传物质C、附着D、致病性（05）1．证明某壹细菌是否存在鞭毛有那些实验方法？（7分）（03）聚beta羟丁酸颗粒储存的营养要素是？用途及优点？（01）4.放线菌放线菌革兰氏染色结果？（99）工业发酵产抗生素放线菌主要借助哪种方式产生新的菌丝体有性孢子无性孢子菌丝体断裂有性结合（2000）试以链霉菌为例简述放线菌的生活史？（01）在显微镜下，链霉菌的气生菌丝和基内菌丝相比，颜色（）、直径（）。
（生物科技行业）初级检验技师考试微生物检验考试试题及答案初级检验技师考试微生物检验考试试题及答案(4)壹、名词解释1.感染2.侵袭力3.毒血症4.败血症5.带菌者6.内毒素7.外毒素8.菌血症9.脓毒血症10.类毒素11.菌群失调12.条件致病菌13.致病菌14.细菌毒力15.侵袭力16.医院内源性感染17.医院感染18.外源性感染/交叉感染19.医源性感染20.非特异性免疫二、填空题1．病原菌的致病性和其具有的毒力，侵入的及有密切关系。
2.细菌的毒力是由和决定的。
3.细菌的侵袭力是由、和构成。
4.内毒素是菌细胞壁中的成分。
5.内毒素是由脂质A，和组成。
6.内毒素的毒性部分是，菌体抗原（O抗原）是。
7.类毒素是由经甲醛处理制备而成，可刺激机体产生。
8.外毒素的化学成分是，可用甲醛处理制备。
9.根据外毒素的作用机理不同，可将外毒素分为，和肠毒素。
10.抗毒素可由或刺激机体产生。
11.构成非特异性免疫的屏障结构主要有皮肤和粘膜屏障，和。
12.吞噬细胞吞噬病原菌后的结果有吞噬和吞噬俩种。
13.内毒素的毒性作用有，，，。
14.目前所知毒性最强的生物毒素是。
15.以神经毒素致病的细菌有，等。
16.具有粘附作用的细菌结构有，。
17.具有抗吞噬作用的细菌结构有等。
18.病原菌侵入机体能否致病和，，等有密切关系。
19.细菌侵袭性酶有，，等。
20.定居于人和中的微生物群叫做正常菌群。
21.医院内感染的方式包括、和。
三、单项选择题1.和细菌致病性无关的结构是A.荚膜B.菌毛C.异染颗粒D.脂多糖E.磷壁酸2.细菌代谢产物中，和致病性无关的是A.毒素B.血浆凝固酶C.热原质D.细菌素E.透明质酸酶3.和细菌侵袭力无关的物质是A.荚膜B.菌毛C.血浆凝固酶D.芽胞E.透明质酸酶4.具有粘附作用的细菌结构是A.鞭毛B.普通菌毛C.荚膜D.性菌毛E.芽胞5.革兰阳性菌类似菌毛作用的成分是A.肽聚糖B.M蛋白C.膜磷壁酸D.壁磷壁酸E.SPA6.有助于细菌在体内扩散的物质是A.菌毛B.荚膜C.M蛋白D.血浆凝固酶E.透明质酸酶7.细菌内毒素的成分是A.H抗原B.肽聚糖C.O抗原D.荚膜多糖E.脂多糖8.内毒素的中心成分是A.特异性多糖B.脂多糖C.核心多糖D.脂质AE.脂蛋白9.内毒素不具有的毒性作用是A.食物中毒B.发热C.休克D.DICE.白细胞反应10.关于内毒素的叙述，下列错误的壹项是A.来源于革兰阴性菌B.能用甲醛脱毒制成类毒素C.其化学成分是脂多糖D.性质稳定，耐热E.只有当菌体死亡裂解后才释放出来11.关于外毒素的叙述，下列错误的是A.多由革兰阳性菌产生B.化学成分是蛋白质C.耐热，使用高压蒸汽灭菌法仍不能将其破坏D.经甲醛处理可制备成类毒素E.可刺激机体产生抗毒素12.外毒素的特点之壹是A.多由革兰阴性菌产生B.可制备成类毒素C.多为细菌裂解后释放D.化学组成是脂多糖E.耐热13.细菌毒素中，毒性最强的是A.破伤风痉挛毒素B.霍乱肠毒素C.白喉外毒素D.肉毒毒素E.金黄色葡萄球菌肠毒素14.以神经毒素致病的细菌是A.伤寒沙门菌B.霍乱弧菌C.肉毒梭菌D.乙型溶血性链球菌E.脑膜炎奈氏菌15.不能引起食物中毒的细菌是A.金黄色葡萄球菌B.破伤风杆菌C.肉毒梭菌D.产气荚膜杆菌E.肠炎沙门菌16.抗毒素A.为外毒素经甲醛处理后获得B.可中和游离外毒素的毒性作用C.可中和和易感细胞结合的外毒素的毒性作用D.可中和细菌内毒素的毒性作用E.B+C17.类毒素是A.抗毒素经甲醛处理后的物质B.内毒素经甲醛处理后脱毒而保持抗原性的物质C.外毒素经甲醛处理后脱毒而保持抗原性的物质D.细菌经甲醛处理后的物质E.外毒素经甲醛处理后脱毒且改变了抗原性的物质18.下述细菌中可引起菌血症的是A.破伤风梭菌B.伤寒沙门菌C.白喉棒状杆菌D.肉毒梭菌E.霍乱弧菌19.带菌者是指A.体内带有正常菌群者B.病原菌潜伏在体内，不向体外排菌者C.体内带有条件致病菌者D.感染后，临床症状消失，但体内病原菌未被彻底清除，又不断向体外排菌者E.感染后，临床症状明显，且可传染他人者20.对机体非特异性免疫叙述，错误的是A.在种系发育和进化过程中形成B.和生具有，人皆有之C.对某种细菌感染针对性强D.和机体的组织结构和生理功能密切相关E.对入侵的病原菌最先发挥作用21.不属于正常体液和组织中的抗菌物质是A.补体B.溶菌酶C.抗生素D.乙型溶素E.白细胞素22.关于抗感染免疫的叙述，下列错误的是A.完整的皮肤和粘膜屏障是抗感染的第壹道防线B.吞噬细胞和体液中的杀菌物质是抗感染的第二道防线。
微生物的鉴定方法总结2020微生物鉴定技术新技术新方法32、1 细胞壁组分分析32、2 红外光谱IR32、3 气相色谱GC42、4 高效液相色谱HPLC42、5 质谱分析MS43 微生物鉴别方法传统方法在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。
在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。
1、1 细菌微菌落技术细菌的形态、大小、颜色及其它特征与细菌的基本生物学特性如代谢类型、分裂方式、繁殖速度等有密切关系。
肉眼所见菌落，即大菌落是由大量的菌体紧密堆积而成，有不少生物学特性不能辨别；微菌落则是指细菌生长繁殖早期在固相载体上形成的只能借助显微镜进行观察的细菌集落。
与大菌落相比，微菌落边缘及中央有明显不同的表形特征。
可据此对微生物的种类进行鉴定。
缺点：受操作人员主观性影响大。
（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
（2）群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。
如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。
1、2 生理生化反应特征（1）利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。
（生物科技行业）微生物和生物医学实验室生物安全通用准则微生物和生物医学实验室生物安全通用准则1.实验室的分类、分级及适用范围1.1分类1.1.1壹般生物安全防护实验室(不使用实验脊椎动物和昆虫)。
1.1.2实验脊椎动物生物安全防护实验室。
1.2分级每类生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度各分为四级。
各级实验室的生物安全防护要求依次为：壹级最低，四级最高。
1.3适用范围1.3.1壹般生物安全防护实验室l.3.1.1壹级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。
1.3.1.2二级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。
1.3.1.3三级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。
艾滋病病毒的研究(血清学实验除外)应在三级生物安全防护实验室中进行。
1.3.1.4四级生物安全防护实验室实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。
和上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安全防护实验室中进行。
待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在四级仍是在较低级别的实验室中处理。
1.3.2实验脊椎动物生物安全防护实验室，其适用微生物范围和同级的壹般生物安全防护实验室相同。
2．壹般生物安全防护实验室的基本要求2.1壹级生物安全防护实验室2.1.1安全设备和个体防护2.1.1.1壹般无须使用生物安全柜等专用安全设备。
2.1.1.2工作人员在实验时应穿工作服，戴防护眼镜。
2.1.1.3工作人员手上有皮肤破损或皮疹时应戴手套。
2.1.2实验室设计和建造的特殊要求2.1.2.1每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。
微生物基础试验实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的1、掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法；2、了解培养基的配制原理；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法。
二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。
培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
三、试剂与器材1、器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2、试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2、干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温摇床→降温→开箱取物3、高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4、过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1、要严格按配方配制。
2、调pH不要过头。
3、干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。
4、高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5、过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
六、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么？3、培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么？4、培养基的配制原则是什么？实验二土壤中微生物分离纯化培养一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；掌握微生物培养方法；2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
（生物科技行业）江苏大学考研微生物资料第六章微生物的生长及其控制1、名词解释：生长产量常数（Y），最适生长温度，巴氏消毒法，抗生素，抗代谢药物，选择毒力，生长限制因子。
生长产量常数（Y）：指菌体产量和限制性营养物消耗的比例关系。
最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。
巴氏消毒法：用较低的温度处理牛乳或其他液态食品，杀死其中可能存在的无芽孢病原菌而又不损害营养和风味的消毒方法。
抗生素：抗生素是生物在其生命活动中产生的壹种次生代谢产物或其人工衍生物，能对他种生物的生命活动产生抑制作用或致死作用。
抗代谢药物：又称代谢拮抗物、代谢类似物，是指在结构上和生物体所必需的代谢物相似，能够和正常代谢途径中特定的酶发生竞争性反应，从而阻碍酶的功能、干扰代谢的正常进行的物质。
选择毒力：抗生素对人体及动、植物组织的毒力，壹般远小于它对致病毒的毒力，这称为抗生素的选择毒力。
生长限制因子:凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，就称生长限制因子。
MIC：最小抑菌浓度，表示某药物对某菌的最小抑菌浓度，常以μg/ml或μ/ml 来表示。
2、什么是典型生长曲线？它可分几期？划分的依据是什么？各期特点如何？典型生长曲线：将少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中培养。
在适宜条件下，其群体就会有规律地生长，定时取样测定细胞含量，以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就能够画出壹条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。
划分的依据：单细胞微生物。
特点：(1)延滞期(停滞期、调整期)：a.生长速率常数为零；b.细胞形态变大或增大；c.细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。
d.合成代谢活跃；e.对外界不良条件的反应敏感。
(2)对数期：菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，代时短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态和生理特征最壹致，抗不良环境的能力强。
（生物科技行业）微生物学微生物学第一章绪言一、微生物概述1、什么是微生物微生物(microbe，microorganism)通常是描述一切不借助显微镜用肉眼看不见的微小生物。
这类微生物包括病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物和某些藻类。
微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。
因此，微生物通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类，它们的大小和特征见表1.1所示。
但是有些例外，如许多真菌的子实体、蘑菇等常肉眼可见；相同的，某些藻类能生长几米长。
一般来说微生物可以认为是相当简单的生物，大多数的细菌、原生动物、某些藻类和真菌是单细胞的微生物，即使为多细胞的微生物，也没有许多的细胞类型。
病毒甚至没有细胞，只有蛋白质外壳包围着的遗传物质，且不能独立存活。
表1.1 微生物形态、大小和细胞类型2、生物中哪些是微生物3、微生物的特点a个体微小，结构简单在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。
物生非细胞生物病毒、亚病毒细胞生物原核生物真细菌、古细菌真核生物生动物真菌、单细胞藻类、原b繁殖快生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。
c代谢类型多，活性强。
d分布广泛有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。
e数量多在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。
f易变异相对于高等生物而言，较容易发生变异。
在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。
微生物种内的遗传多样性非常丰富。
所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
二、微生物学的重要性微生物与人类生活所有方面紧密联系，下面仅列出几个：1、环境微生物在碳循环、氮循环和磷循环(地球化学循环)中承担主要作用，构成生物体的所有基本成分。
微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色:革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
（生物科技行业）微生物常规鉴定技术微生物常规鉴定技术壹、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。
，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色:革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤：（1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。
（2）晾干：和简单染色法相同。
（3）固定，和简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染5min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，且判断菌体的革兰氏染色反应性。
（13）实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
注意擦镜头时向壹个方向擦拭。
②见后的染色玻片用废纸将香柏油擦干Aseptictechnique:Streakplate:二、生理生化试验微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别壹些在形态和其它方面不易区别的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之壹。
微生物检验中常用的生化反应有：1、尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。
尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。
其活性最适pH为7.0。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。
或涂布且穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。
培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
2、氧化酶（Oxidase）试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。
阴性者无颜色改变。
应在数分钟内判定试验结果。
注意事项：（1）盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，且在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
（2）铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
（3）在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气和菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
3、过氧化氢酶的测定过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。
1．试剂：3－10％过氧化氢（H2O2）2．菌种培养：将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养18－24h。
3．试验方法：取壹干净的载波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1环培养18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。
也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
4．注意事项：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。
4、甲基红（MethylRed）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进壹步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于MR－VP生化鉴定管，于36通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。
故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0之上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
5、V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰和蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
试验方法：１）O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。
亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。
２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
３）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物壹接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。
不产酸的培养物不能使用。
本试验壹般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
6、含碳化合物的利用细菌能否利用某些含碳化合物作为唯壹碳源，反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定依据。
测定的基础培养基配方很多，因种而异。
现介绍1种合成的基础培养基，有些细菌仍可适当补加各种维生素。
培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平板。
可用于测定的底物种类很多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。
糖的含量壹般为1％，醇类酚类等的含量壹般为0.1－0.2％，氨基酸的含量壹般为0.5％。
因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或加入到45℃的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。
有些底物不宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基础培养基中，某些醇类和酚类不必灭菌。
接种和观察结果：菌种最好做成悬液，避免带入少量碳源干扰试验结果。
平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。
每壹测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。
适温培养2、5、7天后观察，凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。
假若俩种培养基上生长情况差别不明显，开在同壹培养基上连续移种3次，如差别仍不明显则以阴性论。
7、葡萄糖的氧化发酵试验在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。
细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另壹种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。
前者包括的菌种类型为多数。
氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。
为此，Hugh和Leifson提出壹种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。
这壹试验广泛用于细菌鉴定。
壹般用葡萄糖作为糖类代表。
也可利用这壹基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。
（1）接种：以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖（凡士林：液体石蜡＝1：1混合后灭菌），约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。
另2管不封油为开管，同时仍要有不接种的闭管作对照。
适温培养1、2、4、7天观察结果。
（2）结果观察：氧化型产酸――仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1－2d），后来才稍变酸。
发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
8、糖或醇类发酵试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
