肠道菌的分离与鉴定

一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地衣）。

5种有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。

4种二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。

5种需氧菌：芽孢杆菌。

1种兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。

2种注：境中生长最好。

最适温度为37～42℃。

在正常大气或无氧环境中均不能生长。

肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。

三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。

需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。

四、无氧环境的简易操作：1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采用干燥器培养，1m3空间用焦性没食子酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上。

继而放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。

盖上缸盖并用石蜡封闭。

再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。

置于温箱37℃培养24一48h观察结果。

2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖,放入密封性较好的玻璃罐(用凡士林封口)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。

五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。

一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须小于1000ppm（千分之一），更严格的环境是小于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。

实验肠道菌的分离与鉴定实验三肠道菌的分离与鉴定-1 1.录像：细菌感染的实验室诊断；2学生操作2.学生操作：粪便标本的采集与细菌分离（接种麦康凯平板）抗酸染色3.讨论：沙门菌感染的鉴别诊断（肥达氏实验）细菌学诊断常通过直接通过分离出病原菌达到疾病诊断的目的。

目的有时也可通过检测病原菌的抗原成分特殊代产物或其抗原成分、特殊代谢产物或其核酸达到诊断目的。

原理血清学诊断用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。

(抗原→未知抗体)标本双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高≥4倍者方有意义种类肥达试验、外斐试验、显微镜凝集试验等凝集试验：沉淀试验：肥达试验外斐试验显微镜凝集试验等梅毒VDRL 、RPR 试验等抗“O”补体结合试验：中和试验：抗O 试验等Q 热柯克斯体抗体检测等一、病原学诊断与防治一般检验程序、病原学诊断与防治临床标本般检验程序预处理增菌涂片染色快速诊断试验初步诊接种培养基，分离单个菌落断报告各种鉴定试验生化试验血清学实验涂片染色药敏试验动物试验最终诊断报告肠道菌的分离与鉴定⏹实验目的实目的熟练无菌操作掌握粪便的细菌学检查过程实⏹实验步骤粪标本采集法（一）目的对粪便标本的检验有助于评估病人排泄功能及准确评估疾病。

颜色、、1、常规标本用于检查粪便的性状用于检查粪便的性状、、颜色混合物及寄生虫等。

混合物及寄生虫等2、隐血标本用于检查粪便内肉眼不能观察到的微量血液。

到的微量血液用于检查寄生虫成虫、、幼3、寄生虫及虫卵标本用于检查寄生虫成虫虫及虫卵。

虫及虫卵用于检查粪便中的致病菌。

4、培养标本用于检查粪便中的致病菌蜡纸盒或容器（（如小瓶如小瓶、、塑料盒或（二）用物蜡纸盒或容器竹签。

培养标本备无菌培养管或无菌便器））、竹签便器蜡纸盒和无菌长棉签、、竹签蜡纸盒和无菌长棉签（三）方法：操作前必要时用屏风或床帘遮挡病人。

粪便标本采取、保存（甘油保存液）、送检（一）分离培养（分区划线接种）（）分离培养（分区划线接种）革兰染色（二）分离培养（分区划线接种）氧化酶试验肉汤接种（增菌）（三）接种生化反应条、药敏试验（）察读（四）结果观察和判读（一）分离培养取标本直接在用棉签取标本，直接在麦康凯平板上划第上划第ⅠⅠ区，再用接种环进行第进行第ⅡⅡ、第，再种第Ⅲ、Ⅳ区的划线。

肠道致病菌的分离与鉴定一、实验目的(1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤(2)掌握平板划线分离法(3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义二、实验材料(1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程(1)肠道致病菌的分离①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。

②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。

将培养基置于37C培养18~24小时。

(2)肠道致病菌的纯化①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。

②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。

（3）肠道致病菌的鉴定①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。

取出并观察记录现象。

（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。

取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。

（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。

肠道菌的分离与鉴定1. 介绍肠道菌是生活在人体肠道中的一种微生物群落，它们在人的健康和疾病的发生中发挥着重要作用。

肠道菌的分离与鉴定是一项重要的实验技术，它可以帮助我们了解肠道菌的种类和数量，为进一步研究肠道菌与人体健康之间的关系提供基础数据。

2. 实验步骤2.1 收集样品首先需要收集肠道样品，常用的样品包括粪便和肠道黏膜。

粪便样品可以通过自然排泄获得，肠道黏膜样品则需要通过内镜检查或者手术采集。

2.2 分离菌落将样品分别加入含有富集培养基的培养皿中，培养皿需提前灭菌处理。

然后将培养皿置于适宜的温度、湿度和气体环境下进行培养，通常是在37摄氏度的恒温培养箱中。

待菌落生长到一定大小后，用移液器或铁环等工具进行分离，将菌落单独转移到含有琼脂的培养皿中。

2.3 纯化菌株将分离得到的菌落转移到含有琼脂的培养皿中后，再次进行培养，待菌落生长成纯种菌株后，进行单菌落转接。

即将单个菌落划取至新的培养皿中，使其继续增殖。

通过多次转接，可以得到纯化的菌株。

2.4 鉴定菌株2.4.1 形态学鉴定对分离得到的菌株进行形态学观察，包括形状、色素、大小等特征。

通过肉眼观察或显微镜观察，可以初步确定菌株的分类。

2.4.2 生理生化特性鉴定利用一系列的生理生化试验，可以进一步鉴定菌株。

常用的试验包括氧需求量、产酸产气反应、氧化还原酶试验等。

通过观察菌株在不同培养基和条件下的生长情况，可以推测出菌株的类群。

2.4.3 分子生物学鉴定利用分子生物学技术可以准确鉴定菌株。

例如，可以通过16S rRNA基因测序来确定菌株的分类，或者应用PCR技术检测菌株是否具有特定的基因或基因片段。

2.5 保存菌株将鉴定完的纯化菌株保存起来，可通过冷冻保存或划线保存的方式进行。

划线保存即将菌株划移到含有琼脂的培养皿上，形成菌斑。

冷冻保存就是将菌株以甘油为载体，置于低温下保存。

3. 结果分析通过肠道菌的分离与鉴定，我们可以获得多个菌株，并了解它们的形态学、生理生化特性和分类信息。

实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本：肛门拭子培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子分离培养革兰染色（血平板）革兰染色触酶实验甘露醇实验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。

重点：色素和溶血现象•2、革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。

结果观察•1、菌落观察•2、形态学观察（二）生化反应•触酶试验：(-) (+)H 2o 2H 2o o 2氧化氢酶+菌种：可疑菌落试剂：3%过氧化氢方法：见右图结果：见右图甘露醇实验•甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论：现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论：咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验荚膜染色（石炭酸复红单染）分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转，10分钟分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。