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EMSA 操作流程寡核苷酸标记：1．将序列互补的寡核苷酸片断在TEN-buffer（10mM Tris, 1mM EDTA, 0.1M Nacl, pH8.0）中按摩尔比1：1混合。
2．95℃10min使核苷酸片断充分解离。
3．将样品缓慢冷却至15-25℃。
4．用灭过菌的TEN-buffer将核酸稀释至3-4pmol/ul5．取3.85pmol 或100ng 稀释好的核苷酸加入小炮弹管中，并加入ddH2O 使终体积达到10ul。
（对照管中加入1ul对照寡核苷酸（管6）和9ul的ddH2O）。
6．将以上小管放在冰上并依次加入以下试剂：4ul 5×Labeling buffer（管1）4ul CoCl2-solution （管2）1ul DIG-ddUTP solution （管3）1ul 末端转移酶（400U）（管4）7．小心的将以上溶液混匀并迅速进行离心。
8．在37℃反应15min，之后置于冰上。
9．加入2ul 0.2 M EDTA (pH8.0)终止反应。
10．再加入3ul ddH2O，使终体积达到25ul，标记好的寡核苷酸浓度达到4ng/ul 或0.155pmol/ul。
标记效率测定：11．试剂准备：见样品检测部分的试剂准备。
12．按下表制备系列稀释的制备标记寡核苷酸和对照组标记寡核苷酸。
13．各取对照组和制备组1-5号管中标记的寡核苷酸1ul 点在尼龙膜上14．紫外灯下交联5min 或120℃烤30min 使标记的寡核苷酸固定在膜上。
15．15-25℃在Washing buffer 中漂洗膜2min。
16．在10ml Blocking solution 中孵育30min。
17．在20ml Anitybody solution 中孵育30min。
18．用10ml Washing buffer 漂洗两次，每次15min。
19．在10ml Detection buffer 中平衡2-5min。
emsa原理EMSA原理：深入解析信息安全信息安全是当今互联网领域关注的热点话题，在这个数字化时代，用户的隐私保护成为人们越来越关心的问题。
而EMSA（Encoding Method for Signature Authentication），作为一种数字签名认证算法，采用的是非对称加密的方式，被广泛应用于信息安全领域。
以下将从EMSA原理的解析、应用场景以及未来发展几个方面来探讨这一算法的重要性。
一、EMSA原理的解析EMSA算法，是指将拥有固定长度的消息通过哈希算法生成摘要值，再采用非对称加密算法对摘要值进行签名，从而实现消息认证的过程。
具体而言，EMSA算法包括以下步骤：1. 将原始消息进行哈希运算，生成定长的摘要值。
2. 将生成的摘要值与 RSA 密钥对中的私钥进行非对称加密，形成数字签名。
3. 将原始消息与数字签名发送至接收方。
4. 接收方使用 RSA 公钥进行数字签名解密，得到摘要值及原始消息。
5. 将原始消息进行哈希运算，比对生成的摘要值和解密的摘要值是否相同。
如果相同，则说明消息来源可信；否则说明存在篡改或伪造的可能。
相比于其他数字签名算法，EMSA算法具有以下优点：1. 安全性高：由于摘要值具有唯一性，同时数字签名的非对称加密方法也极其安全，可以有效地保证消息的真实性和完整性。
2. 签名效率高：哈希算法具有高效的特性，可以快速地生成摘要值，远远高于对称加密算法。
3. 签名内容简短：由于采用哈希算法生成固定长度的摘要值，数字签名的长度相对较短，方便传输和存储。
二、EMSA的应用场景EMSA算法在信息安全领域具有广泛的应用，主要涵盖以下两个方面：1. 数字签名认证数字签名认证是指通过数字签名的方式，加密传输的数据，确保数据的完整性和真实性。
而EMSA算法在数字签名认证技术中起到了至关重要的作用，具体应用在以下场景：（1）电子合同签署在电子商务领域，电子合同签署需要双方进行数字签名认证，将合同内容加密传输至对方，保证合同的真实性和完整性。
概述EMSA (Encoder-Modulator-Sampler-Adversary) 技术是一种用于数据隐写的通用方法。
它可以隐藏消息在一个密文中，使得仅有授权的接收方能够解读。
EMSA技术的基本原理包括以下几个步骤：编码、调制、采样和对抗。
在EMSA技术中，编码步骤将明文消息转换为一个二进制序列，以便嵌入到密文中。
调制步骤将这个二进制序列转换为一系列的密文符号，即将消息隐藏在密文中。
采样步骤在调制后的信号中进行采样，以便提取出隐藏的消息。
对抗步骤是为了保护隐藏的消息免受攻击者的窃取，通过引入噪音来增强隐藏的隐写信息。
在下面的文章中，我们将详细介绍每个步骤的原理，并说明它们如何协同工作以实现数据隐写的目的。
编码编码是EMSA技术的第一个步骤，它负责将明文消息转换为一个二进制序列。
通常，这个过程涉及到将明文消息进行编码，以便它可以稍后嵌入到密文中。
编码器的目标是将明文消息转换为一系列具有统计保密性的二进制位。
在编码步骤中，可以使用各种编码算法，如哈夫曼编码、RLE编码等。
这些编码算法可以将明文消息表示为一个更紧凑的二进制形式，减少占用的存储空间。
在选择编码算法时，需要考虑到编码的准确性、速度和存储效率。
调制调制是EMSA技术的第二个步骤，它负责将编码后的二进制序列转换为一系列的密文符号。
调制器的目标是将消息隐藏在一个看起来与原始信号无关的形式中，以迷惑攻击者。
在调制步骤中，可以使用各种调制技术，如振幅移位键控 (ASK)、频率移位键控(FSK)、相位移位键控 (PSK) 等。
这些调制技术可以将二进制序列映射到不同的信号特性中，比如振幅、频率或相位。
根据不同的调制技术，调制可以是线性的或非线性的。
采样采样是EMSA技术的第三个步骤，它负责从调制后的信号中提取隐藏的隐写信息。
采样器的目标是以最小的误差率从复杂的信道中恢复出隐藏的消息。
在采样步骤中，通常会使用采样定理来决定采样率。
采样定理指出，为了能够准确还原原始信号，采样率必须高于信号中最高频率的两倍。
凝胶迁移阻滞实验（EMSA）实验操作方法及注意事项凝胶迁移阻滞实验（EMSA）转载丁香园大神的帖子！非常详细！EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的! EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA 操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否!简介:EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
发展:从发展史来看,这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,所以从定购到标记再到做完试验,必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术,这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术.在实践中没多久,地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷,标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术.配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题,到目前为止, 生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用!EMSA试验成功的关键因素:1.1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!!3.探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点:关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20μl脱气10min10% AP（过硫酸氨）120μl总量20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)l 2×Blocking Buffer（2×封闭液）(4 oC)l 5×Washing Buffer（5×洗涤液）(4 oC)l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)3. 结合反应每次结合反应需1-5μl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15μl （1）结合反应体系：10X 结合反应液1.5μlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl细胞核提取物* ? μl双蒸水* ? μl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5μl总量15μl混匀室温静置20分钟或以上。
EMSA实验技术及方法简介实验简介凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF 在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。
同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。
03 年上一篇关于ChIP方法的介绍文献攻击EMSA 没有考虑细胞内完整自然的染色质结构和调节的影响而受到很大的限制！下面是在一个PROTOCAL1.探针的标记：(1) 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针(1.75pmol/微升) 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]A TP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升总体积10微升按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，V ortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
(2) 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
(3) 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
(4) 再加入89微升TE，混匀。
此时可以取少量探针用于检测标记的效率。
通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。
EMSA原理简介
EMSA（Expectation-Maximization Sequence Analysis）是一种基于序列分析的统计
方法，主要用于序列分类、序列比对、序列结构预测等领域。
该方法采用统计模型来描述
序列相似性和差异性，并通过最大似然估计来推断模型参数，从而实现序列处理。
EMSA方法常常用于生物领域中的DNA序列分析、RNA序列翻译、蛋白序列比对等方面。
EMSA方法的核心思想是通过期望最大化算法来寻找序列中隐藏的模式和信息。
这种方法最初是由Baum-Welch在20世纪70年代提出的，用于寻找隐马尔科夫模型中的参数估计。
随着计算机技术的飞速发展，EMSA方法被广泛应用于序列分析领域中，成为序列分析的一种有效工具。
EMSA方法主要分为两步。
第一步是期望步骤（Expectation），根据当前模型参数下的序列数据，计算对应的期望值；第二步是最大化步骤（Maximization），根据期望值更新
模型参数，使得目标函数达到最大化。
这样交替进行期望步骤和最大化步骤，直到目标函
数收敛。
EMSA方法另一优点是能够处理缺失数据或不完整的数据，且不需要知道先验信息，因此更加灵活。
EMSA方法在序列分析中的应用非常广泛，例如DNA序列分析中的基因预测、蛋白质序列分析中的结构预测、RNA序列翻译中的密码子优化等。
其中，EMSA可以有效检测DNA中
的启动子、剪接位点、保守序列以及基因组重排等特征，并在蛋白质序列比对中发挥重要
作用。
在RNA序列翻译方面，EMSA可以优化编码基因中的密码子使用频率，提高蛋白质翻译效率。
emsa实验方法与过程EMSA实验方法与过程EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的蛋白质-核酸相互作用分析方法，可以用于检测DNA结合蛋白的存在、纯度和活性。
本文将介绍EMSA实验的方法与过程。
实验方法：1. DNA探针制备：将目标DNA序列合成或从基因组中扩增，然后标记为放射性同位素或非放射性标记物。
2. 蛋白质提取：从细胞或组织中提取目标蛋白质，可以使用细胞裂解液或纯化蛋白质。
3. EMSA反应：将标记的DNA探针与提取的蛋白质混合，形成蛋白质-核酸复合物。
然后将反应混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中，进行电泳分离。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将反应混合物电泳分离，根据蛋白质-核酸复合物的大小和电荷，可以观察到不同的带状图案。
5. 膜转移：将凝胶上的DNA和蛋白质转移到膜上，然后用放射自显影或非放射性探针检测蛋白质-核酸复合物。
实验过程：1. 准备实验材料：包括DNA探针、蛋白质提取液、聚丙烯酰胺凝胶、电泳缓冲液等。
2. 制备DNA探针：将目标DNA序列合成或扩增，然后标记为放射性同位素或非放射性标记物。
3. 蛋白质提取：从细胞或组织中提取目标蛋白质，可以使用细胞裂解液或纯化蛋白质。
4. EMSA反应：将标记的DNA探针与提取的蛋白质混合，形成蛋白质-核酸复合物。
然后将反应混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中，进行电泳分离。
5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将反应混合物电泳分离，根据蛋白质-核酸复合物的大小和电荷，可以观察到不同的带状图案。
6. 膜转移：将凝胶上的DNA和蛋白质转移到膜上，然后用放射自显影或非放射性探针检测蛋白质-核酸复合物。
EMSA实验是一种简单、快速、灵敏的蛋白质-核酸相互作用分析方法，可以用于检测DNA结合蛋白的存在、纯度和活性。
在实验过程中，需要注意控制实验条件，避免误差的产生。
同时，还需要注意实验安全，避免放射性同位素对实验人员造成伤害。
EMAS1. 配置6%的SDS-PAGE蛋白胶，凝结30min。
2．预电泳：100v，30-60min，在预电泳过程中配置如下表结合反应，加入探针之前先混匀反应液，室温静置10min，加入探针后再静置20min。
Component Final Amount Control Reactions#1 #2 #3Ultrapure Water ---- 12μL 11μL 9μL10X Binding Buffer 1X 2μL 2μL 2μL50% Glycerol 2.5% 1μL 1μL 1μL100mM MgCl2 5mM 1μL 1μL 1μL1μg/μL Poly (dI•dC) 50 ng/μL 1μL 1μL 1μL1% NP-40 0.05% 1μL 1μL 1μLProtein extract 2μL2μL-----Biotin probe 2μL----- 2μLTotal Volume ---- 20μL 20μL 20μL3. 加入5μl 5×Loding Buffer，轻柔上下吹匀，不可剧烈混匀4. 电泳：100V电泳30-40min，溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳5. 将尼龙膜剪成与蛋白胶大小相同或稍小，剪角做标记，浸于0.5×TBE，至少10min。
6. 用冷却至4°C的0.5×TBE和干净的海绵，镊子，手套进行转膜7. 100V，380mA 4°C转膜30-60min，8. 转膜结束后，将膜（带有溴酚蓝的一面）放在干纸巾上1min，使膜表面的缓冲液吸进膜内, 不能使膜变干。
立即进行80°C 高温交联2h9. 用15ml 加热至42°C的封闭液Blocking Buffer封闭膜，轻柔摇床孵育15min10. 将50μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至16ml Blocking Buffer中，配制Conjugate/ Blocking Buffer。
简介及原理：
EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白或细胞粗提液与标记的DNA或RNA探针一同孵育，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
主要试剂和仪器：
1. 蛋白质预染分子量marker、NC膜、ECL发光试剂盒、总蛋白测定试剂盒
全功能激光影像成像系统、高速组织捣碎机、电泳仪、电泳槽、转印槽、低温高速离心机、超低温冰箱、分光光度计、脱色摇床
2. 一般binding所用试剂盒包括的试剂
10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20℃)
Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物(-20℃)
6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4℃)
Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20℃)
Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20℃)
Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4℃)
2×Blocking Buffer（2×封闭液）(4℃)
5×Washing Buffer（5×洗涤液）(4℃)
Equilibration Solution（平衡液）(4℃)
Binding-membrane（结合反应膜）(RT)
操作步骤：
1. 探针的标记：
⑴将20μl生物素标记的N4-dCTP与80μl的5×dNTP混合物充分混合备用。
⑵稀释约100ng线性探针模板至24μl于离心管中。
⑶加入10μl随机引物与上述离心管中，煮沸变性5min，迅速在冰水混合物中退火5min。
⑷加入10μlN4-dCTP与5×dNTP的混合物，5μl反应缓冲液，1μlklenow酶片，混匀。
⑸37℃孵育60min，
⑹加入2μl的EDTA以灭活klenow酶活性。
合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程。
2.探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：
(1)对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积
4.EMSA结合反应：
(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：阴性对照反应：
样品反应：
探针冷竞争反应：
突变探针的冷竞争反应：
Super-shift反应：
(2) 蛋白与核酸孵育
按照上述顺序依次加入各种试剂，注意在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置20分钟，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
(3) 制样
在9μl的孵育产物中加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。
4. 电泳分析：
(1)用0.5×TBE作为电泳液。
(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。
在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1×的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
(3)按照10V/厘米的电压电泳。
确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。
电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。
小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。
小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。
滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。
把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
(5)干胶仪器上干燥EMSA胶。
然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。
其中:
探针用量: 这相当于10-50 fmol的DNA探针。
我们通常是最少50fmol.
蛋白样品用量: 一般用量在2～20ug(控制在1-5μl)蛋白, 总体系15ul。
细胞核抽提物浓度都比较低，组织的一般都比较高，因为杂蛋白较多。
poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶组成。
由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。
在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。
当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。
对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。
未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探针来说,其实就是没有标记的转录因子的寡核苷酸，用量一般是正常探真的50-100倍。
◆常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
◆阴性对照反应(标记探针);
◆探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；
◆突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；
◆Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)。
