iCell原代软骨细胞培养体系

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软骨细胞培养流程
《软骨细胞培养流程》
软骨细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究软骨细胞的生长、增殖和分化。

软骨细胞是一种特殊的细胞，具有重要的支持和维持软骨组织结构和功能的作用。

软骨细胞培养流程需要一系列精细的操作和严格的实验条件。

首先，要获得软骨组织样品，可以从实验动物或人体骨骼中获取。

然后将软骨组织样品切割成小块，并用消化酶处理，以释放软骨细胞。

接下来，将释放的软骨细胞收集并进行离心，去除异物和细胞碎片。

然后将软骨细胞将种植到培养皿中，添加适当的细胞培养基，并将培养皿放入细胞培养箱中进行培养。

在细胞培养过程中，需要密切观察软骨细胞的生长状态，定期更换培养基，并进行细胞传代。

此外，还需要进行细胞鉴定、纯化和分化培养等步骤，以确保所培养的细胞具有良好的生长和分化能力。

软骨细胞培养流程需要严格控制细胞生长环境的温度、湿度、气体和营养物质等条件，以确保细胞的稳定生长和繁殖。

另外，在细胞培养过程中也需要注意防止细菌、真菌和病毒的污染，保持细胞培养环境的洁净和安全。

通过细胞培养技术，研究人员可以获取大量的软骨细胞用于进一步的实验研究，以深入了解软骨细胞的生物学特性和功能，为软骨组织工程和临床治疗提供重要的基础和支持。

、概念、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经‎首次传代成功‎即成细胞系，由原先存在于‎原代培养物中‎的细胞世系（Lineag‎ e of Cells）所组成。

2、细胞株（Cell Strain‎）：通过选择法或‎克隆形成法从‎原代培养物或‎细胞系中获得‎具有特殊性质‎或标志物称为‎细胞株。

细胞株的特殊‎性质或标志必‎须在整个培养‎期间始终存在‎。

如果不能继续‎传代或传代数‎有限，称为有限细胞‎株（finite‎c ell strain‎）；如果可以连续‎传代，称为连续细胞‎株（contin‎u ous cell strain‎）。

对于人类肿瘤‎细胞，在体外培养半‎年以上，生长稳定，并连续传代的‎即可称为连续‎性株或系。

二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外‎培养群可被认‎可为己鉴定的‎细胞，视具体情况而‎定，无统一规定。

对于用作原代‎培养的细胞只‎要供体均一，取材部位及组‎织种类等条件‎稳定即可，如用做长期培‎养，特别是反复传‎代的细胞，常需做如下说‎明：1、组织来源：细胞供体所属‎物种，来自人体或者‎动物；个体性别、年龄；取材的器官或‎组织。

如系肿瘤组织‎，应说明临床和‎病理诊断，以及病历号等‎。

2、细胞生物学检‎测：了解细胞一般‎和特殊的生物‎学性状，如细胞一般形‎态，特异结构，细胞生长曲线‎和分裂指数，倍增时间，接种率等。

如为肿瘤细胞‎，为说明来源于‎原肿瘤组织并‎保持恶性，须做软琼脂培‎养，异体接种致瘤‎和对正常组织‎侵润力等实验‎。

3、培养条件和方‎法；应说明细胞系‎（或株）适应的生存环‎境，即指明使用的‎培养基、血清种类、用量以及适宜‎P H值。

三、若干细胞建株‎的要点及基本‎过程（一）肿瘤细胞培养‎技术要点1、取材：材料主要来源‎于外科手术或‎活检瘤组织，取材时避免用‎坏死组织，要挑选瘤细胞‎集中和活力较‎好的部位，瘤性转移淋巴‎结或胸腹水是‎较好的培养材‎料。

取材后尽快培‎养，因故不能立即‎培养者，可冻存。

骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。

2）按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3）0.22µM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。

4）包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。

2. 0.1% I型胶原酶（1mg/ml）100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。

3. D-hank’s液（可以直接购买使用）KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。

以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用;4. 血清的灭活:常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。

灭活后-20℃保存备用;5. 细胞生长液的配制(100mL):即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。

6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22µM过滤后分装备用，-20℃保存;7. 75%乙醇8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水二.实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml离心管三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank’s洗3次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约0.1cm3小块↓移至离心管，Hank’s洗3次↓静置1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml↓悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2↓4d换液，以后每天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液1次。

1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。

转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。

剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。

使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。

使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。

培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。

2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。

离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。

采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。

四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。

纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。

（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法。

方法采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞，经差速贴壁法纯化后，培养液中培养。

倒置显微镜观察细胞形态，生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞。

结果经过两步消化和差速贴壁后，成功培养出高纯度的肌源性干细胞，细胞免疫荧光结果为desmin(+)。

结论通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞，结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定，为组织工程的临床应用提供种子细胞。

【关键词】大鼠肌源性干细胞体外培养Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods By two-step method, the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin, and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells wasanalysed through studying growth curve, and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro 近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。

原代角质形成细胞的分离培养方法原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。

原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，可以获得更准确的研究和数据。

为了更好的服务于广大科研工作者，赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法，技术因人而异仅供参考：角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。

根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。

基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。

角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。

在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。

细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。

需要的实验试剂：1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系4.基础培养基：DMEM/F125.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.46.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶9.75%医用酒精10.胎牛血清（FBS）实验器械：1.培养皿2.T-25细胞培养瓶3.100目不锈钢网筛4.200目不锈钢网筛5.眼科剪6.眼科镊7.离心管（15ml、50ml）实验步骤：1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。

体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。

最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。

我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。

一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。

无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。

这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。

为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。

而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。

当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。

再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。

改良分步消化法培养原代软骨细胞田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【摘要】背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h 后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.%BACKGROUND: Combination of trypsin and bacterial collagenase to digest articulate cartilage matrix is widely used at home and abroad. Some studies have shown that the method steps is tedious, process is complicated, and cell is easy to pollution, but the better simple, safe and reliable method has rarely been reported.OBJECTIVE: To obtain highly purified and large amount of chondrocytes by improved stepwise digestion method. METHODS: Six 3-week-old New Zealand rabbits were divided into two groups: The experimental group was cultured by two-step enzyme digestion, and the control group was cultured by the traditional enzyme digestion method. The growth condition of chondrocytes was observed in the two group after 1 week,and cell counting and identification was performed. We estimated improved method to evaluate the influence of cells.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the traditional method, this method spent shorter time to digest chondrocytes. After 24 hours, the primary chondrocytes in the two groups were mostly round at a suspending state. After 48 hours, the cells began to adhere. The results demonstrated that the improved method shortens digestion time, and easy to obtain a great amount of purified chondrocytes.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)020【总页数】3页(P3633-3635)【关键词】软骨细胞;关节软骨;细胞分离;原代培养;组织工程【作者】田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【作者单位】宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004【正文语种】中文【中图分类】R318背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂，容易污染，但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。