FISH实验

荧光原位杂交fish检测目的
荧光原位杂交（FISH）是一种重要的分子生物学技术，用于在细胞或组织的原位上检测特定的DNA序列。

在医学和生物学研究中，FISH技术广泛应用于基因诊断、染色体分析和肿瘤研究等领域。

FISH检测的主要目的包括以下几个方面：
基因诊断：通过FISH技术可以检测基因的异常表达、基因突变和染色体异常等，用于诊断遗传性疾病、罕见病和癌症等疾病。

例如，针对乳腺癌的HER-2基因扩增检测，有助于指导靶向治疗和预后评估。

染色体分析：FISH技术可以用于检测染色体数目和结构的异常，对于产前诊断和遗传咨询具有重要意义。

通过检测染色体异常，可以预测胎儿是否存在遗传性疾病的风险。

肿瘤研究：FISH技术在肿瘤学研究中主要用于检测肿瘤细胞的基因变异、基因扩增和染色体异常等。

这些信息有助于了解肿瘤的病因、发展机制和耐药性等方面，为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供依据。

靶向治疗：在靶向治疗中，FISH技术可以用于检测肿瘤细胞是否存在特定的基因变异，从而指导医生选择合适的药物和治疗方案。

例如，肺癌的EGFR基因突变检测，有助于选择靶向EGFR的药物进行治疗。

总之，FISH技术作为一种重要的分子生物学技术，在医学和生物学研究中具有广泛的应用价值。

通过FISH检测，人们可以深入了解基因、染色体和肿瘤等方面的信息，为疾病诊断、治疗和预后评估提供有力支持。

FISH检测标本要求FISH（荧光原位杂交）是一种基因诊断技术，可用于检测染色体异常或一些基因的扩增、缺失或重排等变异。

在进行FISH检测时，标本的质量和处理方法对检测结果至关重要。

下面是FISH检测标本所需的一些要求：1.标本类型：FISH检测可以使用不同类型的标本，包括固定组织切片、细胞悬液或细胞块等。

标本的选择取决于要检测的疾病类型和目标基因。

2.标本采集：标本采集必须严格按照操作规范进行，以确保标本的完整性和准确性。

对于组织切片标本，应按照标准的组织取样技术采集。

对于细胞悬液或细胞块标本，应使用无菌工具采集，并避免污染或损伤细胞。

3.标本固定：标本固定是指使用合适的固定剂将标本中的细胞或组织固定在载玻片上，以便进行后续处理。

常用的固定剂包括4%的甲醛和乙酸乙酯等。

固定必须足够强度以保持细胞形态和染色质结构的完整性。

4.标本处理：标本处理是指对固定的标本进行前处理步骤，以去除固定剂、蛋白质等，以提高FISH信号的强度和清晰度。

标本处理涉及细胞膜的渗透性改变、DNA的变性和解聚，以及FISH探针结合的条件等。

标本处理通常包括脱水、去脂、裂解和蛋白酶消化等步骤。

5.FISH探针：FISH探针是用于与目标DNA序列特异性结合的荧光标记探针。

对于不同的FISH应用，需要选择不同的探针，如诊断性FISH探针、定量FISH探针和断裂FISH探针等。

探针的选择应根据需要检测的基因、染色体和疾病类型进行。

6.标本稳定性：标本的稳定性是指在采集和处理过程中，标本中的核酸和蛋白质的完整性是否保持良好，以确保准确的FISH结果。

标本应在适当的温度下存储，并且在处理之前应避免冻结和解冻的过程。

7.检测结果的解读：FISH检测结果的解读应由经验丰富的专业人员进行，因为FISH结果的解读涉及对不同信号模式、缺失或重排等变异类型的鉴别。

除了以上的要求，FISH检测标本还应根据具体的疾病类型和检测需求，进行其他特定的处理步骤和质量控制。

FISH操作步骤FISH (fluorescence in situ hybridization)是一种分子生物学技术，用于检测和定位细胞中的基因序列，以及染色体的异常。

下面是进行FISH实验的详细步骤：1.制备细胞悬液：从样品中提取细胞，例如组织切片、细胞培养物或血液等。

确保样品新鲜，并尽可能减少细胞的损伤。

2.固定样品：将细胞悬液投放在玻片上，并用适当浓度的溶液固定细胞。

通常使用4%的乙醛或乙醇进行固定，可以尽量保持细胞结构和染色体的完整性。

3.制备FISH探针：FISH探针是用于探测特定DNA序列的标记分子。

探针可以使用基于DNA或RNA的技术进行制备，并标记上荧光分子，如荧光染料。

选择合适的探针，以便与要检测的目标序列互补。

4.水解：在用于FISH的组织样品中，通常需要进行DNA的水解过程，以使DNA链能够更好地与FISH探针结合。

水解可以通过使用裂解剂如盐酸或HCl，以及加热和冷却步骤来实现。

5.探针杂交：将制备好的FISH探针加到制备好的细胞悬液或玻片上，并在恒温条件下进行杂交。

在探针结合过程中，探针的特异性序列与目标DNA序列互补，形成一个稳定的结合复合物。

6. 洗涤：在探针杂交完成后，需要进行反复的洗涤步骤，以去除非特异性结合的探针和杂质。

洗涤可以使用低盐缓冲液来实现，如2× SSC (0.3 mol/L NaCl, 0.03 mol/L sodium citrate) 或PBS（磷酸盐缓冲液）。

7. 核染色：为了观察细胞和染色体的结构，可以进行核染色，以将细胞核染成特定颜色。

常用的核染色剂有DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)、Hoechst、Propidium iodide等。

8.显微镜观察：直接将FISH样品放置在显微镜下，观察探针的荧光标记和核染色的情况。

使用荧光显微镜观察，可以看到探针结合的位置以及染色体上的信号。

9.图像采集和分析：使用数字相机或其他图像采集设备，记录FISH 实验的图像。

FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（荧光原位杂交）是一种用于检测DNA或RNA序列的实验技术。

该技术结合了传统原位杂交和荧光显微镜技术，可以在细胞或组织样本中定位、标记和可视化特定的DNA或RNA分子。

下面是一个典型的FISH实验的步骤：1.准备标记探针：选择适当的探针来标记目标DNA或RNA序列。

探针通常是短的DNA或RNA片段，与目标序列互补，可以与其发生特异性杂交。

这些探针可以使用不同的标记物进行标记，如荧光染料或辐射性同位素。

2.样品制备：根据需要，制备细胞悬液或组织切片样品。

细胞悬液可以通过离心细胞，将细胞固定在载玻片上。

组织切片可以使用刮片或切片机获得，然后固定在载玻片上。

3.固定样品：将细胞悬液或组织切片固定在载玻片上，以保持细胞或组织的形态结构。

常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。

4. 渗透化处理：使用渗透化剂渗透细胞或组织样品，以增加探针和标记物的进入性能。

常用的渗透化剂包括蛋白酶K和Triton X-100。

5.探针杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA序列结合。

首先在浓度适宜的探针液中孵育样品，使探针与目标序列发生杂交。

温度和时间取决于探针和目标序列的碱基组成和长度，通常需要在高温下进行，以增加探针与目标序列的特异性。

6.杂交后的冲洗：使用适当的缓冲液冲洗样品，以去除未结合的探针和杂交条件中的非特异性结合。

冲洗通常需要进行多次，以确保特异性结合。

7.荧光染色：如果探针是荧光标记的，在杂交后可以直接进行荧光染色。

将样品浸泡在适当浓度的荧光染料中，以标记目标序列。

染色时间通常较短，一般在15-30分钟左右。

8.荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察和记录标记的目标序列的位置和数量。

使用适当的滤光片来选择和分离目标染色的荧光波长。

利用计算机软件，可以对显微镜下的图像进行分析和处理，以获得更多的信息。

在进行FISH实验时，需要注意一些技术细节和注意事项：1.适当的正向和阴性对照是必要的，以确保实验的准确性和可靠性。

FISH检测在临床上的应用FISH检测在临床上的应用一、简介- FISH（Fluorescence in situ hybridization）即原位荧光杂交技术，是一种用于研究基因组和染色体结构的分子生物学技术。

- FISH检测在临床应用中可以提供重要的染色体遗传学信息，用于诊断和监测某些疾病。

二、FISH检测的原理- FISH技术基于荧光标记的核酸探针与细胞或组织标本中的特定DNA序列发生互补杂交，通过荧光显微镜观察以检测特定基因组或染色体的异常。

- FISH检测可以提供高度准确的定量和定位信息，特别适用于检测具有微小或亚显性突变的染色体异常。

三、临床应用领域1、适用于癌症诊断和分型- FISH检测可以检测染色体上的特定基因重排，从而辅助癌症的诊断、分型和治疗方案的选择。

- 例如，FISH检测可以用于检测BCR-ABL融合基因以确认慢性髓性白血病的诊断。

2、适用于先天性遗传病的筛选和诊断- FISH检测可用于检测染色体异常，如唐氏综合征（21三体综合征）、爱德华氏综合征（18三体综合征）和智商障碍相关的染色体异常，用于婴儿和先天性遗传病的筛选和诊断。

3、适用于遗传性肿瘤相关基因的检测- FISH检测可以用于检测和定位遗传性肿瘤相关基因的异常，如BRCA1和BRCA2基因异常与乳腺癌和卵巢癌的遗传风险相关。

4、适用于感染性疾病的诊断和追踪- FISH检测可以用于检测和定位细菌、和寄生虫等感染性病原体的核酸序列，辅助感染性疾病的诊断和追踪。

四、技术要点和注意事项1、样本处理- 对于固定的细胞或组织标本，需要进行脱脂、脱水等预处理步骤。

- 不同类型的标本可能需要不同的处理方法，如骨髓涂片、组织切片等。

- 样本处理过程中需注意保持核酸完整性和避免污染。

2、探针设计与标记- 根据要检测的目标基因或染色体序列设计特异性的核酸探针。

- 核酸探针需要选择适当的荧光染料进行标记，以便在荧光显微镜中观察到。

- 标记的探针需要存储在适当的条件下，以保持标记稳定性和活性。

FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。

二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况 三仪器设备及耗材（一） 仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。

可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。

10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。

12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。

（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。

）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。

四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。

试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml 胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。

FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。

掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。

临床诊断中的FISH检测FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。

FISH 检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。

FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。

下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。

探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。

FISH检测的准确性来源于探针的设计。

FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。

用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。

而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。

荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。

以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb-400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原-抗体反应对荧光信号进行放大。

Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。

FISH检测对被测样本没有特殊的要求。

可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。

甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。

获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。

我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。

FISH检测标本要求FISH（荧光原位杂交）被广泛应用于基因组学和细胞遗传学领域，用于检测染色体异常、基因扩增、基因融合及基因定位等。

对于进行FISH检测的样本，有一些要求需要满足，以确保检测结果的准确性和可靠性。

以下是FISH检测标本的要求：1.标本类型：FISH检测可以应用于多种不同的样本类型，包括固定细胞、血液、组织、骨髓、体液等。

具体选择何种样本类型应根据所需检测的目的来决定。

2.标本采集：标本采集应在临床上病情活体检查或治疗之前，并避免使用抗生素等干扰因素。

采集的样本应尽量新鲜，以避免DNA的降解和破坏。

对于外周血样本，常规采用采血管内导管的方式获得可大量的细胞样本。

3.标本固定：固定样本的目的是阻止细胞的自溶和降解，保持细胞的形态结构。

常用的样本固定剂包括甲醛、氯醋酸、琼脂糖等。

固定时间通常为24至48小时，不同样本类型和实验需求可能会有所不同。

4.样本处理：在进行FISH检测前，需要将样本进行一系列的处理步骤来去除可能存在的蛋白质、核酸或其他干扰物质，以确保FISH信号的清晰度和可见性。

处理步骤包括：蛋白酶消化、DNA解旋、脱色、去噪等。

5.样本制备：样本制备是FISH检测中非常重要的一步。

首先，将固定的细胞或组织样本进行切片或悬液制备。

对于细胞悬液，可以通过离心等方法获得高纯度的细胞。

对于组织，切片需要足够薄，以便光线可以通过并确保信号的清晰度。

6.探针选择：FISH检测使用到荧光标记的探针来定位特定的基因序列或染色体异常。

根据所需检测的目的，选择合适的探针。

对于染色体异常的检测，可以选择染色体特异性或基因特异性探针。

7.检测技术：在进行FISH检测时，需要使用高分辨率荧光显微镜来观察信号。

同时，还需要使用图像分析软件来分析和计算信号的数量和强度，并最终确定特定基因序列或染色体是否存在异常。

总之，从样本采集到最终的FISH检测结果，需要严格遵守一系列的操作步骤和要求，以确保检测结果的准确性和可靠性。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。

其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。