课题3 酵母细胞的固定化
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课题3 酵母细胞的固定化
1．固定化酶的应用实例——生产高果糖浆
(1)反应原理：葡萄糖――――――→葡萄糖异构酶果糖。
(2)生产原理：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装入反应柱中，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液可以自由出入。
(3)生产操作：①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。
(4)固定化酶的优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。
2．固定化酶和固定化细胞技术
(1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
(2)常用方法[连线]：
(3)载体：包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
3．制备固定化酵母细胞
酵母细胞的活化—— 向盛有干酵母的小烧杯中加入蒸馏水使其由休眠状态恢复正常生活状态
配制CaCl2溶液——| 物质的量浓度为0.05 mol/L
配制海藻酸钠溶液—— 用酒精灯加热时要边加热边搅拌并且要小火间断加热，反复几次
海藻酸钠溶液与酵母细胞混合—— 向冷却至室温的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中
固定化酵母细胞—— 以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，浸泡30 min左右
4．用固定化酵母细胞发酵
(1)操作步骤：
固定好的酵母细胞(凝胶珠)―→用蒸馏水冲洗2～3次――→加入到用于发酵的葡萄糖溶液中。
(2)现象 有气泡产生有酒精味散发
5.直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
酶的种类 一种或几种 一种 一系列酶
常用载体 无 硅胶、凝胶 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺
制作方法 无 化学结合固定化、物理吸附固定化 包埋法固定化
是否需要
营养物质 否 否 是
催化反应 单一或多种 单一 一系列
反应底物 各种物质(大分子、小分子) 各种物质(大分子、小分子) 小分子物质
优点 催化效率高、低耗能、低污染等 ①既能与反应物接触，又能与产物分离，提高了产品质量
②可重复使用，降低了成本 成本更低、操作更容易
缺点 ①对环境条件非常敏感，易失活②酶难回收，成本高，影响产品质量 不利于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接触，尤其是大分子物质，可能导致反应效率下降
实例 果胶酶 固定化葡萄糖异构酶 固定化酵母细胞
特别提醒：
1．制备固定化酵母细胞的注意事项
(1)在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞需要的活化时间较短，一般为0.5～1 h，但实验时需要提前做好准备。
(2)酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出。
(3)加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，关系到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
(4)海藻酸钠的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
(5)溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高而导致酵母菌死亡。
(6)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照。
(7)海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30 min左右。
(8)细胞的固定化要在严格无菌的条件下进行；反复使用固定化酵母细胞时，酵母菌种要纯，用具和材料要严格消毒，注意温度控制，营养全面，还需要避免其他微生物的污染。
2．实验结果分析与评价
(1)如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。
(2)利用固定的酵母细胞发酵产生酒精[C6H12O6――→酶2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量]，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味，而不含酵母菌的凝胶珠所做的对照实验则无此现象。
1.右图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答：
(1)请在横线上填出各标号的名称。
①_________________，②______________，③_____________________。
(2)固定化酶的优点在于(多选)( )
A．能被重复利用 B．减少生产成本，操作容易
C．有利于提高酶活性 D．有利于产物的纯化
(3)③的作用是_____________________________________________________________。
(4)制作固定化葡萄糖异构酶所用的方式有___________________或_________________。
(5)研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将从大肠杆菌中得到的三磷酸酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与微生物降解相比，其作用不需要适宜的( )
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
2. 如图为固定化酵母细胞及其应用的相关图解，请据图回答问题：
(1)某生物小组利用海藻酸钠制备固定化酵母细胞，应使用图甲中的方法[ ]__________(填号码及名称)，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是____________________________________。
(2)部分同学制得的凝胶珠如图乙所示，其原因可能是___________________、____________________等。观察形成的凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明_________________________。
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。
①a代表________，b代表________。
②从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原因是_________________________________。
③为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程一定要在________条件下进行。
④装置中的长导管起的作用是____________________________________________________。
3. 乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，具有重要应用价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如下：
产乳糖酶微生物L的筛选―→产乳糖酶微生物L的培养―→乳糖酶的提取纯化―→乳糖酶的固定化
(1)筛选产乳糖酶的微生物L时，宜用_________________作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼脂
的作用是_________________。从功能上讲，这种培养基属于_________________。
(2)培养微生物L前，宜采用_________________方法对接种环进行灭菌。
(3)纯化后的乳糖酶可用电泳法检测其分子量大小。在相同条件下，带电荷相同的蛋白质电泳速度越快，说明其分子量越_________________。
(4)乳糖酶宜采用化学结合法(共价键结合法)进行固定化，可通过检测固定化乳糖酶的________________________确定其应用价值。除化学结合法外，酶的固定化方法还包括____________________、____________________ 、离子吸附法及交联法等。
4. 下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答下列问题。
酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞
(1)在______状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复______状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时_______________________________。
(2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用________________和__________________。
(3)影响实验成败的关键步骤是___________________________________________。
(4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是________________________________________。
(5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞数目________。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明____________________________________。
(6)该实验中CaCl2溶液的作用是_____________________________________。
5. 请回答有关固定化酶与固定化细胞技术的问题。
(1)在实际生产中，固定化酶技术的优点是_________________________________________________。
与固定化酶技术相比，固定化细胞固定的是_______________________。
(2)制备固定化酵母细胞，常用的包埋材料是____________，使用了下图中方法[ ]____________(填出号码及名称)。
(3)制作固定化酵母菌细胞时，充分混合均匀的酵母细胞胶液可在________溶液中形成凝胶珠。部分同学实验制得的凝胶珠不是圆形或椭圆形，其主要原因是__________________________________________。
