项目名称：胸腺的起源、发生、维持与退化首席科学家：张毓北京大学起止年限：2010.9至2015.9依托部门：教育部二、预期目标1．总体目标通过该项目的实施，整合我国胸腺发育研究的主要力量，形成一个有竞争力的研究团队，协同解决该领域的一些重大问题，在胸腺的物种和胚胎起源，胸腺上皮细胞发育分化及其表观遗传调控机制，发育中TEC和胸腺细胞间的相互作用，胸腺退化的意义和发生机制等方向上取得一批原创性的成果，并力争在表观遗传和器官退化理论方面有所创新，努力使我国成为国际上这一前沿领域的学术研究中心之一。
通过该项目的实施，产生针对胸腺功能低下相关病理状态进行医学干预的新思路，发现一些具有自主知识产权和药物开发前景的分子靶标，为应对即将到来的老龄化社会所要面临的人口健康和社会经济发展方面的挑战提供理论和技术储备。
2．五年预期目标1）建立和完善胸腺器官发育研究技术和方法，重点发展能够支持胸腺上皮细胞前体发育的体外培养体系和单个前体细胞胸腺内移植技术。
2）分析鉴定文昌鱼中存在的原始胸腺上皮细胞和原始胸腺样细胞，揭示原始胸腺的胚胎起源，提供无脊椎动物原始胸腺发生的证据。
3）阐明Mpc2及Bcl-3调控基因表达和胸腺上皮细胞发育分化的表观遗传机制。
4）揭示LT-LTβR信号对TEC发育分化及其所介导的阴性选择的影响，确立Netrin和Slit在胸腺细胞定向迁移中的作用。
5）分析胸腺退化对外周T细胞库重塑及对固有免疫应答和记忆免疫应答的影响，揭示Mpc2、LTβ、Bcl-3和Aire在胸腺上皮细胞前体维持中可能发挥的作用。
6）发现和鉴定出10个以上与胸腺发育或退化相关的新分子（mRNA、miRNA或蛋白质），阐明它们调控胸腺发育或退化的机理，并确定它们是否具有临床应用前景。
7）发表高水平论文（影响因子＞5）20-30篇，包括2-4篇顶级期刊论文，力争在1-2个方向上取得有影响力的、突破性成果。
8）培养博士研究生40-60名，产生长江学者、国家杰出青年基金获得者、中科院“百人计划”级别的人才3-5名，造就一支在胸腺发育研究领域敬业乐业、团结协作、善于攻关的高水平研究队伍。
三、研究方案1．学术思路本项目拟从物种进化、个体发生、维持和退化等不同角度全面研究胸腺器官发育及其调控机制。
作为一个重要的中枢免疫器官，胸腺的起源对免疫进化研究具有重大理论意义，而分析不同物种共享的重要发育调控基因或基因网络可望为深入理解胸腺发育的分子基础做出重要贡献。
对于一个个体，胸腺器官发育很大程度上是指胸腺上皮细胞的发育。
TEC是一种高度特化的上皮细胞，在胸腺中扮演着“组织者”和“教育者”的角色。
有关其发育分化分子基础的研究将聚焦于项目组成员前期工作中发现的两个关键性分子——Mpc2和Bcl-3。
值得一提的是，这两个分子似乎都与表观遗传调控相关，而表观遗传对胸腺发育的影响还是一个未曾被涉猎的领域，相关研究具有很强的开拓性。
众所周知，TEC对于胸腺细胞发育不可或缺。
但近年来的研究显示胸腺细胞也深刻影响着TEC的发育。
已知LT-LT R信号是二者交流的一种关键性媒介，我们特别感兴趣的是该信号如何影响mTEC的发育及其在mTEC介导的胸腺细胞阴性选择中的作用。
本项目关注的最后但也是最重要的问题是胸腺的退化。
其重要性不仅体现在它的医学价值上，同时也在于它实际上反映出的是器官如何维持的问题。
我们认为胸腺退化是一个主动的过程，有着重要但却未知的生理意义。
通过对其生理功能和发生机制的研究，我们期望能产生理论上的突破。
2．技术途径本项目拟使用多种不同模式动物（包括各种基因修饰小鼠），借助常用分子生物学、细胞生物学、免疫学和发育生物学方法，结合高通量检测（如基因芯片、蛋白芯片、ChIP-on-Chip、ChIP-seq、二代DNA测序等）、激光共聚焦成像、基因敲除或转基因技术，从分子、细胞和整体水平研究研究胸腺起源、发生、维持和退化。
总体技术途径见下图，各项研究内容的具体技术线路详见各课题。
四、年度计划第一年研究内容1)文昌鱼胸腺发生发育相关的重要标记分子的鉴定：采用第二代高通量测序技术，测定不同发育阶段的小鼠、爪蟾及斑马鱼胸腺转录组和不同发育阶段文昌鱼转录组; 下载人、小鼠、爪蟾、斑马鱼、文昌鱼等模式动物的转录组和基因组序列；对相关数据进行BLAST分析、聚类和功能注释、分类分析等，通过比较免疫学和比较基因组学分析，鉴定文昌鱼与胸腺发生发育相关的重要标记分子。
2)验证Mpc2对于小鼠胸腺上皮细胞功能的重要性；建立胸腺上皮细胞特异性敲除Mpc2的小鼠模型，并对表型进行比较和分析；建立TEPC培养系统，用基因芯片和小RNA芯片配对筛选差异基因和小RNA；建立基因敲除动物模型和利用不同GPCR刺激胸腺上皮细胞发育的细胞模型。
3)利用RT-PCR，流式细胞术检测LTbR在不同亚群mTEC上的表达水平，比较野生型小鼠和Ltbr-/-小鼠各mTEC亚群的比例和数量；利用RT-PCR，原位杂交，流式细胞仪的方法分析Netrin 和Slit家族成员及其受体家族成员在胸腺细胞及胸腺基质细胞的表达情况，以及在某些细胞因子和特定信号诱导情况下的表达分析；积累、整理汉族RA患者和健康对照样品。
4)小鼠胸腺退化过程中胸腺细胞输出数量和功能的变化；胸腺细胞停止输出或持续高水平输出对外周T细胞库的影响；T细胞及不同T细胞亚群在APAP 肝损伤中的作用。
预期目标1）建立功能注释的不同发育阶段文昌鱼以及不同发育阶段小鼠、爪蟾及斑马鱼胸腺转录组数据库。
2）确认Mpc2-/-小鼠胸腺发育异常是因为胸腺上皮细胞缺陷；证实获得可调控mTEC小RNAs，发现miR-A和其它小RNAs和关键基因的表达调控机制；发现miR-A和其它小RNAs的靶基因；完成各种细胞及动物模型的建立。
3）明确LTbR对各亚群mTEC发育分化的影响；明确Netrin，Slit 家族及其受体成员在胸腺内的表达模式和表达调控，为后续的功能分析打下基础；完成对汉族RA患者和健康对照样品的整理。
4）初步阐明退化过程中胸腺细胞输出数量和功能变化的规律；初步揭示胸腺输出对记忆性T细胞群体维持的影响；初步阐述T细胞是否以及如何参与调控APAP肝损伤；初步阐述IL6在APAP肝损伤中的作用机制。
5）培养博士生5-10人，发表论文4-6篇。
第二年研究内容1）文昌鱼胸腺发生发育重要标记分子的克隆；文昌鱼胸腺发生发育重要标记分子表达特征研究；胸腺发生发育重要标记分子的功能研究包括胸腺发生关键基因功能，胸腺发育关键信号通路基因功能。
2）利用BrdU掺入技术，流式细胞术检测LTbR对不同亚群mTEC増殖和更新的作用；芯片技术比较分析LTbR信号有和无时，各亚群mTEC基因表达差异；通过Transwell，[3H]掺入，AnnexinV染色等方法分析Netrin和Slit 信号对胸腺细胞迁移、黏附、增殖和凋亡的影响；采用Illumina BeadStation 500GX 微阵基因分型系统,对汉族RA患者的样品进行全基因组扫描，定位与RA遗传相关的SNPs位点。
3）分析高表达Mpc2的胸腺上皮细胞类群，分析Mpc2-/-胸腺中该类群细胞的数量和主要功能；寻找Mpc2影响T细胞增殖的主要信号通路及重要下游基因；验证获得的差异基因和小RNA；研究小RNA和关键基因的表达调控机制；预测和验证小RNA的靶基因，功能证实差异的基因和小RNA；构建Aire、Insulin 等基因启动子GFP报告系统，功能筛选siRNA文库；确定影响胸腺上皮细胞发育的特定GPCR刺激，发现新的未知核内转录因子4）继续有关退化过程中胸腺细胞输出数量和功能变化的研究；胸腺退化过程中胸腺上皮结构、基质细胞数量和亚群、上皮细胞增殖和凋亡的改变。
改变胸腺输出对记忆性免疫应答的影响；MyD88或/和TRIF3缺陷对正常胸腺退化进程的影响；T细胞及不同T细胞亚群在APAP肝损伤中的作用；B细胞在APAP 肝损伤中的作用。
5）项目中期评估，对研究内容作必要调整。
预期目标1）发现和鉴定10-20个文昌鱼与胸腺发生发育相关的重要标志分子基因，并初步阐明这些基因特点和表达规律。
2）确定Mpc2高表达的细胞亚群；在TEC中验证相关基因的表达并获得相关数据；功能证实差异的基因和小RNAs；功能筛选siRNA文库；揭示G蛋白偶联受体在胸腺上皮细胞发育对表观遗传网络的调节作用，进一步分析影响GPCRs信号蛋白（如β-arrestins）的已知和未知的核内转录因子表达谱。
3）明确LTbR信号对各亚群mTEC在増殖和更新方面的作用；建立LTbR信号调节的各亚群mTEC的基因表达谱，为下一步分子机制的研究奠定基础；明确Netrin对胸腺细胞的迁移，以及与细胞外基质相互作用，对胸腺细胞增殖的作用以及细胞凋亡的影响；明确Slit对胸腺细胞的迁移，以及与细胞外基质相互作用，对胸腺细胞增殖和凋亡的影响；明确汉族RA患者的SNP的基因分型和定位。
4）确立退化过程中胸腺细胞输出数量和功能变化的规律；初步阐述退化过程中胸腺上皮结构、基质细胞数量和亚群、上皮细胞行为变化的规律；初步阐述TLR信号是否参与胸腺退化的调控；基本阐明T细胞是否以及如何参与调控APAP肝损伤的作用机制；IL6在APAP肝损伤中的作用机制；初步阐述B细胞是否以及如何参与调控NALP3炎症小体反应的机制。
5）培养博士生5-10人，发表论文4-6篇。
第三年研究内容1）文昌鱼原始胸腺细胞的鉴定：采用胸腺发生发育相关的重要标记分子对不同发育阶段文昌鱼进行原位杂交，寻找表达这些标记分子的原始胸腺上皮细胞和原始胸腺细胞，确定这些细胞的位置和组织分布规律；重组表达这些重要标记分子，制备抗体，进一步通过免疫组化技术验证这些原始胸腺细胞的存在；制备文昌鱼淋巴样细胞标记分子的探针和抗体，应用原位杂交和免疫组化研究文昌鱼淋巴样细胞和原始胸腺细胞的关系2）使用FTOC系统验证Mpc2-/-胸腺中导致T细胞增殖异常的微环境因子及其作用；阐明Mpc2调控胸腺发育的主要分子机制；培育基因敲除和/或转基因小鼠；进一步证实表观遗传机制调控非经典NF-κB信号传导通路中的调控机制；利用信号转导通路抑制剂和表观遗传修饰酶的抑制剂，以及这些通路及修饰酶相应基因及小分子siRNA、转基因及基因敲除等手段，确定上述刺激及药物调节表观遗传网络的信号通路和在这些调节过程中起关键作用的靶分子。
3）利用shRNA介导的基因沉默技术，FTOC或RFTOC系统，分析候选基因对mTEC 发育分化的作用；利用体外细胞共培养、RT-PCR技术，检测自身反应性T细胞提供的LT-LTbR信号对mTEC中Aire和TRA表达调控的作用；通过FTOC、RFTOC及OP9-DL1共育系统研究Netrin，Slit及其受体对胸腺细胞分化和发育的作用；筛选分析与胸腺发育相关的SNP位点。
