抗体的免疫荧光定量测定法

抗核抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA测定法和免疫印迹测定法。

以下是这些方法的简要介绍和原理：
1.间接免疫荧光法：此方法是检测抗核抗体的常用方法之一。

原理是将待测标本与细胞底物片（如HEp-2细胞）的相应抗原进行反应，然后加入
荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体（通常为抗IgG抗体），形成抗原-抗体-荧光二抗的复合物。

通过荧光显微镜观察，可以判断待测标本中是否存在针对细胞相关抗原的自身抗体。

2.放射免疫法：此方法常用于检测抗DNA抗体。

原理是用同位素标记DNA，与被检血清中的抗DNA抗体结合，然后通过沉淀和对比沉淀物与上
清液中的放射活性，得到DNA的结合活性。

结合率高于一定值（通常为20%）则判断为阳性。

3.ELISA测定法：即酶联免疫吸附法，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗去，最后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。

4.免疫印迹测定法：此方法是将混合的抗原作为凝胶电泳分离，然后转印到硝酸纤维素的薄膜上，再用标记抗体进行检测和分析。

以上各种方法都有其特点和适用范围，可以根据实验需求和条件选择合适的方法进行检测。

免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。

但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。

具体染色方法如下。

1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。

b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。

d. 封闭液。

e. 0.01mol／LPBS缓冲液。

2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。

c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。

阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。

抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。

f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。

抗体浓度测定方法抗体浓度测定是生物医学领域中常用的实验方法之一，主要用于检测样本中抗体的含量，以评估免疫应答的水平或疫苗接种的效果。

下面将介绍几种常见的抗体浓度测定方法。

1.酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是一种常用的抗体浓度测定方法，其基本原理是将抗体与酶标二抗结合，通过酶促反应将抗体固定在固体表面上，再加入底物显色，最后通过吸光度值测定抗体的浓度。

ELISA 具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断、免疫学研究等领域得到广泛应用。

1.放射免疫分析（RIA）RIA是一种利用放射性同位素标记抗体的抗体浓度测定方法。

该方法的基本原理是将抗体与放射性同位素标记的二抗结合，再加入非标记的抗体与之竞争，最后通过放射性信号的强度测定抗体的浓度。

RIA具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，但需要注意放射性同位素的安全使用。

1.免疫荧光法（IF）IF是一种利用荧光标记抗体的抗体浓度测定方法。

该方法的基本原理是将抗体与荧光标记的二抗结合，再加入目标抗原与之反应，最后通过荧光信号的强度测定抗体的浓度。

IF具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，但需要注意荧光信号的稳定性和背景干扰。

1.流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术是一种利用流式细胞仪检测细胞表面或内部抗原的抗体浓度测定方法。

该方法的基本原理是将样本通过流式细胞仪进行检测，同时采用荧光标记的抗体与目标抗原反应，最后通过荧光信号的强度测定抗体的浓度。

流式细胞术具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，但需要注意荧光信号的稳定性和背景干扰。

此外，流式细胞术还可以用于细胞分选、细胞功能分析等领域。

1.免疫印迹法（Western Blot）免疫印迹法是一种用于检测蛋白质表达和鉴定抗原抗体的技术。

该方法的基本原理是将目标抗原分离并通过电泳分离成不同分子量的片段，再通过转印技术将抗原转移到固相膜上，接着加入特异性抗体与之反应，最后通过显色反应测定抗体的浓度。

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。

这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。

固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。

免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。

最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。

总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

基本实验步骤：（1）细胞准备。

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

免疫球蛋白的检测方法免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig）是一类在机体免疫应答中起关键作用的蛋白质，它能够识别和结合抗原，参与免疫反应的调节和执行。

因此，对免疫球蛋白的检测具有重要的临床意义。

本文将介绍免疫球蛋白的检测方法，以及各种方法的优缺点和适用范围。

一、免疫球蛋白的定量检测方法。

1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

ELISA法是一种常用的免疫球蛋白定量检测方法，其原理是利用酶标记抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过底物的反应产生显色反应来定量测定免疫球蛋白的含量。

ELISA法操作简便，灵敏度高，且能够同时检测多个样本，因此被广泛应用于临床诊断和科研领域。

2. 免疫荧光法。

免疫荧光法是利用荧光标记的抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过荧光显微镜观察荧光信号来定量测定免疫球蛋白的含量。

该方法操作简单，对样本的要求较低，且具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测。

二、免疫球蛋白的定性检测方法。

1. 免疫固定电泳法。

免疫固定电泳法是一种通过电泳分离待测血清中的免疫球蛋白亚型的方法。

该方法操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，对于某些免疫球蛋白病的诊断具有重要意义。

2. 免疫印迹法（Western Blot）。

免疫印迹法是一种通过将待测血清中的免疫球蛋白分离并转移至膜上，再通过特异性抗体的结合来检测免疫球蛋白的方法。

该方法具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定。

三、各种方法的优缺点和适用范围。

1. ELISA法的优点是操作简便，灵敏度高，适用于大规模样本的检测，但其缺点是对待测物质的亲和性要求较高。

2. 免疫荧光法的优点是具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测，但其缺点是需要荧光显微镜等专门设备。

3. 免疫固定电泳法的优点是操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，但其缺点是不能进行定量测定。

4. 免疫印迹法的优点是具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定，但其缺点是操作较为繁琐，且耗时较长。

免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。

利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。

免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。

这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。

最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。

基本实验步骤:(1) 细胞准备。

抗核抗体检测方法
抗核抗体检测是一种通过检测人体血清中的抗核抗体（ANA）来评估自身免疫系统功能的方法。

以下是一些常见的抗核抗体检测方法：
1. 免疫荧光法：这是最常用的抗核抗体检测方法。

它使用细胞核素或其成分来作为探针，与患者血清中的抗核抗体结合，并通过荧光显微镜或免疫荧光仪观察标记物的荧光来判定阳性或阴性结果。

2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：这是一种常见的抗体检测方法，通过将抗核抗体与酶标记的抗体结合，再与细胞核素或其成分结合，最后加入酶底物以产生荧光或颜色反应，来判定阳性或阴性结果。

3. 免疫印迹分析（Immunoblot）：这种方法使用电泳将细胞核素或其成分分离开来，然后将其转移到膜上。

然后，将患者血清中的抗核抗体与膜上的目标蛋白结合，并使用酶标记的二抗或放射性同位素进行检测，来判定阳性或阴性结果。

4. 细胞结合抗体测定法：这种方法使用人类细胞进行抗核抗体检测。

血清中的抗核抗体与细胞表面上的细胞核素结合，然后通过荧光显微镜或流式细胞术来观察细胞结合情况，来判定阳性或阴性结果。

这些方法通常会综合使用，以获得更精确的抗核抗体检测结果。

免疫比浊法与免疫荧光定量分析法测量血清降钙素原比较目的：比较免疫比浊法和免疫荧光定量分析法在测量血清降钙素原时的结果。

方法：选取把在笔者所在医院进行降钙素检测的202例浓度不同的血清降钙素，分别用浙江兰森生物科技有限公司生产的乳胶增强免疫比浊法和广州万孚生物公司生产的免疫荧光定量分析法同时进行监测，并对结果和数据进行统计学的分析。

结果：经比较，这两种方法在轻度升高组、低风险组、阴性组的浓度值方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在高度和中度升高组的浓度值方面比较，差异有统计学意义（P＜0.05），免疫比浊法结果稍高于免疫荧光定量分析法的结果；总阳性率的比较方面，差异无统计学意义（P>0.05）。

结论：免疫比浊法和免疫荧光定量分析法均可用于临床血清降钙素原的检测，且免疫荧光法操作比较简便。

[Abstract] Objective：To compare the results of the immune turbidimetric method and immunofluorescence quantitative analysis method in the measurement of serum calcitonin original.Method：202 cases of different concentrations of serum calcitonin were selected，they were all checked by zhejiang ransom biotechnology co.，LTD.Production of latex enhanced immune turbidimetry and guangzhou Wan Fu biological immunofluorescence quantitative analysis production company at the same time，the results and data statistics were analyzed.Result：the concentration values of the two methods in elevated group，the low risk group，negative group had no statistically significant（P>0.05）；the concentration values of the two methods in highly group and moderately elevated group concentration had significant difference （P＜0.05），immune turbidimetry results were slightly higher than the analysis results of immunofluorescence quantitative.The total positive rate of two methods had no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Immune turbidimetry and immunofluorescence quantitative analysis can be used for clinical serum calcitonin original detection，and immunofluorescence operation is more simple.[Key words] Immune turbidimetry；Immune fluorescence quantitative analysis；Serum calcitonin original降钙素原（PCT）就是降钙素的前体，是116个氨基酸所组合成的糖蛋白[1]，主要是神经内分泌细胞（主要包括肺、甲状腺、胰腺组织里面的C细胞）来表达，正常生理的情况下，在血液中是检侧不到的，属于一种脓毒的诱导蛋白，可以作为炎症新的指标，在感染性疾病的鉴别、诊断、抗生素临床应用指导、病情的检测中广泛的应用。