第一讲基因工程
[基础知识·系统化]
知识点一基因工程的基本工具
知识点二基因工程的基本操作程序
知识点三蛋白质工程
[基本技能·问题化]
1．据两种限制酶的作用图示填空
(1)已知限制酶Eco RⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
(2)①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。
(3)Eco RⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
2．观察下图所示过程，回答相关问题
(1)①是限制酶，②是DNA连接酶，二者的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因：自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3．结合抗虫棉的培育过程图填空
(1)从图中可以看出，目的基因是Bt毒蛋白基因，使用的载体是Ti质粒，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。
(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
4．填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。
考点一基因工程的操作工具
命题点(一)限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和
Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓↓↓
——GAATTC————GGATCC————GATC——
——CTTAAG————CCTAGG————CTAG——
↑↑↑
图(a)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经Bam HⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连
接，理由是_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如
图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和
________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析：(1)由题图可知，Bam HⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是
——GATC——
，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经Bam HⅠ酶切得到的目的基因——CTAG——
可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插
入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA 连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶
[重难点拨]
限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
命题点(二)运载体的作用及特点
2．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp r或Tet r中会导致相应的基因失活(Amp r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用Bam HⅠ酶切后，与用Bam HⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
______________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除
满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________；并且__________________________和____________________的细胞也是不能区分的，其原因是____________________________________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有______________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于
