电泳的概念带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为

SDS-PAGE的缺点
• 2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质 （如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白 和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结 构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝 胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数 不呈线性关系。因此，为了测得真实和完 整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法 进行测定和相互验证。
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋 白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓 度的快速、灵敏的方法。
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头， 大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一 个带孔胶粒。
大分子
混合样品 电泳 电泳方向 带孔胶
小分子
按分子 大小分离
• 与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太 多，可以减少上样量。
琼脂糖凝胶电泳
实验原理1
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。
分类
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连 续系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及
凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主 要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统
• 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
marker的选择
• DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正 对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择 在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目 标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是 Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。 如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶 切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却 后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的 粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱 等现象。

凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关
(Gel concentration selection and separation material molecular weight)
二、电泳的原理
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（native－PAGE）

生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不同 ，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和酶 等生物大分子的生物活性。
(Application of electrophoresis)
琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大分 子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸 （DNA和RNA）和蛋白。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacrylamide gel electrophorsis, PAGE)
一、聚丙烯酰胺凝胶的特点
而在电泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。
EB显带（EB banding）
电泳后 EB染色
EB加入凝 胶中电泳
经EB染色后，电泳结果在波长为 254 nm的紫外灯下观察。
[注意] 在分子量相当的情况下，DNA的 电泳迁移率依次为： 超螺旋环状DNA>线状DNA>缺口环状 DNA
三、电泳的应用
(Poly propylene ethylene amines gel characteristics)
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交
联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N
，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵( 简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔 径的大小主要决定于丙烯酰胺的浓度。

第六章电泳技术和常用电泳仪习题参考答案一、名词解释1．电泳：指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。

2．毛细管电泳的电场强度：在给定长度的毛细管两端施加一个电压后所形成的电效应强度。

3．蛋白质的等电点：当溶液的酸碱度处于某一特定pH值时，它将带有相同数量的正、负电荷（即净电荷为零），致使蛋白质分子在电场中不会移动，称此特定的pH值为该蛋白质的等电点。

4．电泳速度：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向移动的距离。

5．迁移率：带电粒子在单位电场强度下的移动速度，常用μ来表示。

6．毛细管电泳技术：是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度（淌度）和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。

7．电泳淌度：带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比。

8．迁移时间：毛细管中，带电粒子在电场作用下作定向移动的时间。

9．毛细管电泳电渗流：在高电压下，溶液中的正电荷与毛细管壁表面的负电荷之间作用，引起流体朝负极方向运动的现象。

10．焦耳热：在高电场下，毛细管中的电解质会产生自热现象，称该热量为焦耳热。

11．电渗：电场中液体对于固体支持物的相对移动。

12.吸附作用：介质对样品的滞留作用。

二、选择题【A型题】1．C2．D3．B4．E5．A6．B7．C8．E9．D10．A11．E12．E13．D14．C15．E16．A17．D18．C19．E20．B21．C22．D23．E24．B25．D26．E27．D28．B29．C30．A31．B32．D33．C34．D35．B36．C37．D38D【X型题】1．ABCE2．ABCD3．ABCDE4．ABCE5．ABCD6．ABCE7．ABE8．ACE9．ABC10．ACDE11．ABCD12．ABCDE13．ABCE14．ABCD15．BCDE16．ABCDE17．BCDE18．ABCE19．ABDE20．ABCDE21．ABCD22．ABCD23．ABCE24．ABCD25．BCDE26．ABDE三、简答题1．简述电泳、电泳技术的概念。

四、名词解释1 ． peptide unit —肽单元，是指一个氨基酸的α - 羧基与另一个氨基酸的α - 氨基脱水生成的酰胺键称为肽键。

参与肽键形成的 6 个原子（ C a 1 、 C 、 O 、 N 、 H 、 C a2 ) 位于同一平面， Ca 1 和 C a 2 在平面上所处的位置为反式构型，此同一平面上的 6 个原子构成所谓的肽单元。

2 ． motif —模体，是具有特殊功能的超二级结构，由两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。

一个模体总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。

3 ． cooperativity —协同效应，指一个亚基与其配体（ Hb 中的配体为 O 2 ）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。

如果能促进作用称为正协同效应；反之，则为负协同效应。

4 ． electrophoresis —电泳，指带电粒子在电场中向带相反电荷一极泳动的现象。

5 ． salt precipitation —盐析，指将中性盐加入蛋白质溶液中，使蛋白质水化膜脱去，电荷被中和，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀。

6 ．分子病—指蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代，都会严重影响空间构象乃至生理功能，甚至导致疾病产生。

这种蛋白质发生变异所导致的疾病，被称之为分子病。

其病因为基因突变所致。

7 ． primary structure of protein —一级结构，是蛋白质分子中，从 N- 端到 C- 端的氨基酸排列顺序。

8 ． chromatography —层析，是蛋白质分离纯化的重要手段之一，待分离蛋白溶液（流动相）经过一种固态物质时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，将待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。

9 ． protein coagulation —蛋白质凝固作用，指蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将 pH 调至等电点，则变性蛋白立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍能溶解于强酸或强碱溶液中。