PCR优化策略

PCR优化策略

特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的 PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。

1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和 1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。

2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。大多数的PCR反应促进剂在高浓度时将会抑制PCR反应。因此在具体实验中应根据PCR反应体系中特定的模板DNA和引物的结合情况来决定PCR反应促进剂的最适浓度。通常在优化PCR反应体系时，应当首先考虑优化反应体系中的常规组成成分，尤其要考虑Mg2+和K+的浓度。

1) DMSO：DMSO有变性DNA的作用，使用10%的DMSO对大肠杆菌DNA聚合酶Klenow I片断是有益的，但是对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此在一般反应中应尽量不用DMSO。然而，在复合PCR中可以用。

2) 甘油：在反应体系中加入5%－20%的甘油有利于PCR反应中的复性，尤其对GC含量高和二级结构多的靶序列以及扩增片段较长的PCR反应中更为适用。但DMSO和甘油并非对所有的PCR反应都有益，应当根据实验的具体情况确定是否在反应体系中加入这些试剂。

3) TMAC：在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可促进PCR反应，去除非特异性扩增而不抑制Taq DNA聚合酶。

4) T4噬菌体基因32蛋白质(gp32)：向PCR反应体系中加入0.5~1?l的gp32(1mmol/L)可改善DNA聚合酶对长片段DNA的扩增。

影响PCR反应的PCR反应促进剂的浓度

名称 抑制 促进

DMSO >10% 5%

PEG >20% 5－15%

甲酰胺 >10% 5% 甘油 >20% 10－15%

Tween 20 未测定 0.1%－2.5%

3. Mg2＋ 浓度调整 ：Mg2＋浓度是一个最容易控制的参数，因为所有的浓度变化都可以在不同的反应管中同时进行。Taq DNA聚合酶的供应商现在除了提供标准缓冲液外还单独提供MgCl2溶液，以简化Mg2＋浓度的调节。一个典型的两步优化过程可以首先包括Mg2＋浓度增幅为0.5mmol/L的从0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反应；当

Mg2＋浓度范围缩小以后再做第二轮优化，采用几个增幅为0.2或0.3mmol/L的Mg2＋浓度。另外其他的离子如NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后, 因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低PCR的严谨性。NH4+也有相同的作用。过高的阳离子浓度 (KCL>0.2M), DNA在94度根本不会发生变性。

4. 优化退火温度：退火温度的优化首先要采用几种方法中的一种来计算引物－模板对的Tm值，其中最简单的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一个单一碱基的错配大约降低Tm值5℃。也可以采用更加复杂的公式，但实践中由于Tm值受缓冲液中各个成分甚至引物和模板浓度的不同影响，所以任何计算的Tm值都应该看作是大致值。进行退火温度的摸索时有一定间隔（2～5℃），从高到低直到低于Tm值5℃的一系列反应可以大致估计出给定条件下的最佳退火温度。

5. 循环参数和再扩增：增加循环数可以增强反应物的不足时的反应，但这样会导致产生假带以及富含单链DNA的高分子量成片产物。对于再扩增，总的原则是，如果第一次PCR反应在凝胶上见到条带，再扩增时只能用1μl第一次PCR产物的1：104到1：105稀释物。

6. DNA聚合酶：Taq酶的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感。Taq 酶是Mg2+依赖性酶因而对Mg2+的浓度最为敏感。以蛙鱼精DNA为模板，dNTP的总浓度在0.7－0.8mmol/L，使用不同浓度的Mg2+进行反应10min，结果表明，Mg2+浓度在2.0mmol/L时酶的活性最高，若Mg2+浓度偏高时，则酶的活性将受到抑制。K+的最适浓度为 50mmol/L，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。50mmol/L的NH4Cl对Taq 酶的活性中等抑制。50mmol/L的NaCl可以提高Taq酶的活性。由于Taq 酶没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各20?mol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq酶的错配率约为0.25%)。

在PCR反应体系中的加入量也很重要，若酶量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增。不同公司的酶效有所不同,需要自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要远远低于Taq 酶,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90－92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证酶的活性。

我们应当根据具体实验的目的来选择特定的耐热DNA聚合酶。例如，当实验的目标是获取一个目的基因的真实拷贝时，就需要选择具有校正阅读功能的聚合酶；然而当实验的目标是克隆一个扩增产物时，能够产生平端切口的聚合酶也许是最佳的选择。然而，当两种或者更多的DNA聚合酶混合在一起使用时能够显著的提高PCR反应的扩增产量，尤其当反应模板核酸为长链DNA时更为明显。这可能是由于各种聚合酶功能上的互补作用使其能够更加容易的使引物延长链顺利地通过模板链上的各种潜在的障碍(包括模板链上的高度二级结构、缺乏末端转移酶活性的聚合酶无法连接的模板链缺口以及使无校正阅读活性的聚合酶停滞并与引物模板杂交链脱离的错配碱基对)。现在许多厂商出售混合配方的耐热DNA聚合酶，以获得在特定的反应体系中所需要的性能。

酶 dNTP(mmol/L) pH Mg2+(mmol/L)

每循环的错误率(错误/掺入碱基对) PCR引起的突需要的循效率(%) 变 环数

pfu 0.1 8.4 1.5 60 7×10-7 0.3 30

Vent 0.5~1.5 8.5 75 70 4.5×10-5 16 26

Taq 0.5~1.5 8.0 5 36 7.2×10-5 25 45

Taq 16.6 8.8 10 88 2×10-4 56 22

7. 引物：最重要的一步是引物的设计。PCR反应所需的引物质量要高，且需纯化，否则引物中相当数量的“错误序列”将导致非特异性扩增和信号强度降低。引物的稳定性：引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的 pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存 2个月。

8. 三磷酸脱氧核苷酸：PCR反应体系中的四种dNTP的浓度应当相等，以使错误掺入率降至最低。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应尤为重要。 dNTP的浓度过高可加快反应速度，同时也增加了碱基错配率和实验成本；降低浓度可导致反应速度下降，但可提高反应的特异性。通常的PCR反应体系中，dNTP的浓度应在20~200?mol/L之间，在此范围内，PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。如在100?l反应液中，当每种dNTP的浓度为20?mol/L时，理论上可以扩增出2.6?g的400bp的DNA。有报道，应用每种浓度低至2?mol/L的dNTP可以成功的检出107拷贝的DNA分子中的一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规的PCR反应中应当避免，因为保持四种dNTP的浓度在其Km值(10~15?mol/L)以上，对保持碱基掺入的忠实性是极为重要的。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响Taq 酶的活性。

9. 热启动PCR ：把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。其操作方法是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值以后才允许反应中的一或两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的PCR管中，所有反应管中的一种公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。

10. 降落PCR（touch－downPCR）：降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应；设计多循环反应的程序，使相连循环的退火温度越来越低、由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在降落PCR中必需应用热启动技术。当引物和模板的同源性未知时，降落PCR 尤其有价值，当引物是根据氨基酸序列设计的简并引物时，或者扩增多基因家族成员时，或者想进行进化PCR时经常会碰到这种情况。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。